[发明专利]一种可以分泌漆酶的工程菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种可以分泌漆酶的工程菌株，所述工程菌株为带有用于重组表达漆酶基因Tfu_1114的热纤梭菌工程菌株，将来源于褐色高温双岐菌Thermobifida fusca的漆酶基因Tfu_1114，通过将该漆酶基因导入热纤梭菌中，构建了重组表达该基因的热纤梭菌工程菌。所述热纤梭菌工程菌能高效表达漆酶。本发明还公开了该热纤梭菌工程菌株可以高效应用于木质纤维素的水解，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以分泌漆酶的工程菌株及其构建方法 与应用。

背景技术

木质纤维素是一类分布广泛、数量庞大、处理困难的可再生资源，将其转化成可再生 能源具有重要意义。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素是一种高 度有序、结合紧密的晶体结构，它与半纤维素紧密相连，外周由木质素包围。木质素通常被认为是限制木质纤维素降解的最重要的因素，木质素通过与细胞壁其他成分的共价连接进一步巩固了细胞壁结构，增加了空间阻力，从而对酶水解起到限制作用，且木质素对酶具有吸附能力，可以通过对纤维素酶的非特异性或非生产性吸附来影响酶水解的效率，因此要将纤维素直接水解成可利用的葡萄糖相当困难。

目前，木质纤维素的酶水解大多使用来源于丝状真菌的纤维素酶，比较典型的有木霉 属、曲霉属和青霉属等，但酶解过程中耗酶量高、活性极易受到产物的抑制，且这些酶蛋 白不耐高温，不耐酸碱，制约了其大规模应用。

嗜热纤维梭菌是目前自然界中已知的降解纤维素最高效的微生物之一，分泌的纤维小 体具有极强的纤维素降解能力。纤维小体降解纤维素的能力大约是木霉属的50倍，这种高 效性取决于纤维小体的特殊结构。热纤梭菌本身是一种严格厌氧的嗜热微生物，特殊的生 长条件，使得分泌的木质纤维素水解酶具有较好的耐热性、杂菌污染的风险极小。

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，能选择性的催化木质素降解而不产生有毒害的物质，而 木质素是影响木质纤维素水解最重要的原因之一，因此将漆酶应用于木质纤维素酶水解中 不仅可以有效提高水解效率，还能有效减少水解液中木质素的含量，为水解液的进一步利 用提供了较好的基础。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种可以分泌漆酶的工程菌株及其构建方 法与应用，通过漆酶的协同作用不仅增强了该热纤梭菌的酶水解效率，经该热纤梭菌水解 后获得的糖液在没有加入活性炭脱色的条件下，其糖液中可溶性木质素的含量与经过活性 炭脱色的糖液相当。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种可以分泌漆酶的工程菌株，所述工程菌 株为带有用于重组表达漆酶基因Tfu_1114的热纤梭菌工程菌株。

所述菌株为将热纤梭菌cel9K中SEQ ID No:1的核苷酸序列替换为漆酶基因Tfu_1114 重组得到的工程菌。

所述漆酶基因Tfu_1114的核苷酸序列为SEQ ID No:2。

所述热纤梭菌工程菌株包括如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

所述漆酶基因Tfu_1114来源于褐色高温双岐菌(Thermobifida fusca)YX的漆酶基因 Tfu_1114。

本发明另一方面提供了一种可以分泌漆酶的工程菌株的构建方法，将漆酶基因Tfu_1114导入热纤梭菌基因组上，构建重组表达该基因的热纤梭菌工程菌，得到可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株。

以热纤梭菌野生菌株为出发菌株，通过替换热纤梭菌基因组上cel9K基因的部分序列 构建融合蛋白来表达漆酶基因Tfu_1114，其中cel9K基因中被替换的基因序列如SEQID No:1所示，漆酶基因Tfu_1114的基因序列如SEQ ID No:2所示。