[发明专利]一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用。本发明公开了一种中脑多巴胺能神经前体细胞，其表达Lmx1a+、Foxa2+、En1+和Otx2+，其中所述中脑多巴胺能神经前体细胞不表达Nkx2.1、DBX1和GBX2中的一种或者多种。制备该中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包括以下步骤：形成拟胚体、得到中脑底板细胞和得到中脑多巴胺能神经前体细胞。该制备方法能够快速高效的从人多能干细胞分化获得中脑多巴胺能神经细胞，解决了现有的分化方法时间较长、效果不稳定、效率低及利用了含血清的培养体系或滋养层细胞不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。

本申请为申请号201910169525.0、申请日2019年03月06日、发明名称“一种中脑多巴胺能神经前体细胞及其制备方法和应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用。

背景技术

帕金森病是最为普遍的神经退行性疾病之一，主要影响中老年人。其症状表现为静止时手、头或嘴非自主地震颤，肌肉僵直、运动缓慢以及姿势平衡障碍等。帕金森病的病因目前仍不明确，但它最主要的病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元发生大量选择性丢失，引起多巴胺合成和分泌不足。脑内需要多巴胺来指挥肌肉的运动，缺乏足够的多巴胺就会影响动作技能、语言能力以及其他功能。帕金森病目前的治疗主要靠左旋多巴制剂，但这无法治愈或逆转病情发展，并且患者需长期用药，以延缓病情进程，控制疾病。

细胞移植治疗帕金森病是通过选择适当的细胞群，移植于宿主脑组织内，替代受损的神经元以重建或恢复神经功能。帕金森患者由于中脑黑质多巴胺能神经元选择性丢失，使它更适合于细胞移植治疗。相比于ESC，iPSC可由人体皮肤、血液等体细胞在体外重编程而来，可成功地绕开了免疫排斥和伦理性两个最关键的问题，为临床上获得体外来源的中脑多巴胺能神经前体细胞进行临床移植提供了可能性。

目前已有多篇研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法。较早诱导多巴胺能神经前体细胞的方法需经过神经上皮干细胞(Neuroepithelial stem cells,NES)的过程(PAX6+)，该分化过程耗时较长，且获得的细胞纯度不高(Koch et al.,2009；Falk et al.,2012)。Friling等报道在使用bFGF等细胞因子的作用下，使用拟胚体分化的方法可以先将人多能干细胞神经化，产生菊形团细胞(Rosettes)中间体结构，再通过音猥因子(Sonic hedgehog,SHH)和成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF8)的刺激获得多巴胺能神经前体细胞，该分化方法操作较为复杂，且分化过程长。虽然早期的分化方法可以诱导成功多巴胺能神经前体细胞，但是仍使用一些成分不确定或含异源成分的细胞基质或试剂，例如Matrigel和血清替代物(Knockout serum replacement,KSR)，这些成分不仅会改变细胞的一些特征，并且不同批次的Matrigel和KSR之间会有差异性，因此很难推广于临床应用。

发明内容

本发明涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用，该中脑多巴胺能神经前体细胞稳定性强且可以大量扩增至4-5代，公开的制备方法能够快速高效的从人多能干细胞分化获得中脑多巴胺细胞，解决了现有的分化方法时间较长、效果不稳定、效率低及利用了含血清的培养体系或滋养层细胞不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。

本发明的具体技术方案如下：

本发明一方面公开了一种中脑多巴胺能神经前体细胞，其表达Lmx1a+、Foxa2+、En1+和Otx2+，其中所述中脑多巴胺能神经前体细胞不表达Nkx2.1、DBX1和GBX2中的一种或多种。

优选的，所述细胞为人细胞。

优选的，所述细胞为非贴壁细胞培养。