[发明专利]间充质干细胞的培养方法及应用

权利要求书

1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、间充质干细胞原代细胞的提取；

S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增；

S3、间充质干细胞的分离。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞、牙髓间充质干细胞原代细胞、脐带间充质干细胞原代细胞、胎盘间充质干细胞原代细胞或脂肪间充质干细胞原代细胞中的任意一种。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合60-80％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入胰蛋白酶消化，细胞收缩变圆后加入上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液离心，弃掉上清液，用PBS离心漂洗，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1-1.5接种至细胞培养皿中，于30-40℃、4-7％CO₂及饱和湿度条件下进行培养2-6天后，细胞融合65-75％时以1：5-8的比例传代至细胞培养皿中。

4.如权利要求3所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述无血清培养基，包括DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶抑制剂、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。

5.如权利要求4所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述无血清培养基还包括抗氧化剂。

6.如权利要求5所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述抗氧化剂为芒果叶提取物、虾青素、改性虾青素中的一种或多种。

7.如权利要求6所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述芒果叶提取物的制备方法如下：将芒果叶干燥后粉碎，然后用65-75wt％乙醇水溶液按料液比1g:(15-30)mL在温度65-75℃下超声提取60-120min，结束后进行抽滤，收集滤液，冷冻干燥，得到芒果叶提取物。

8.如权利要求6所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述改性虾青素的制备方法如下：

L1、在室温下，将4-8重量份甲氧基聚乙二醇与20-30重量份ε-己内酯混合超声8-12min，然后加入0.1-0.2重量份催化剂，继续超声3-7min，然后放入温度120-150℃的油浴中，通入氮气并搅拌反应18-30h，结束后冷却至室温，加入20-30重量份二氯甲烷混合均匀，最后加入80-120重量份无水甲醇混合，将得到的混合过滤，取沉淀冷冻干燥，得到改性共聚物；

L2、将5-8重量份上述改性共聚物溶于8-15重量份丙酮中，再加入2-5重量份虾青素超声4-8min，得到混合液，然后将混合液加入40-60重量份水中搅拌10-30min，随后旋蒸、过滤，滤液冷冻干燥，得到改性虾青素。

9.一种间充质干细胞的应用，其特征在于，将权利要求1-9任一项所述培养方法得到的间充质干细胞用于生产组织和细胞。