[发明专利]一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法

说明书

本发明公开了一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，属于鱼类细胞培养技术领域。本发明通过组织块培养法、酶消化法、肝细胞原代培养基的优化、台盼蓝染色、CCK‑8法、糖原染色、透射电镜鉴定、虹鳟肝细胞支原体检测这八个步骤予以实现。本发明组织块分离法并不适用于虹鳟鱼肝细胞分离，在培养过程中未见细胞从组织块中迁出，而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的分离效果，经0.25％胰蛋白酶消化25min，每克肝重可收集细胞数量达到1.8×108个，平均细胞存活率达到95％；不同培养基和不同血清浓度均会影响细胞贴壁以及生长，含15％FBS DMEM培养基生长效果明显优于MEM、M199以及L15培养基。

技术领域

本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法。

背景技术

鱼类细胞系的建立主要应用于鱼类病毒学、环境毒理学、免疫调节、基因筛选以及功能分析等方面。Qin等建立了斜带石斑鱼脾脏细胞系，并用细胞系去感染虹彩病毒，结果显示，感染后的细胞系表现出明显的病理学效应；Qin等以牙鲆体外培养的鳃细胞系为模型，探讨了壬基酚对牙鲆鳃细胞的毒性影响，发现此类环境激素可以降低鳃细胞抗氧化酶活性；2003年Meng等利用体外培养的草鱼头肾巨噬细胞探讨多种人工合成的寡核苷酸序列和两种不同细菌的基因组DNA对巨噬细胞活化的作用。

肝脏作为鱼体重要的免疫器官，在肝脏细胞系的研究方面，已相继建立了斜带石斑鱼、斑石鲷、半滑舌鳎、剑尾鱼等肝脏细胞系的建立。

当前，在培养过程中细胞从组织块中迁出，没有稳定地分离效果，存活率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养过程中细胞未从组织块中迁出，有稳定地分离效果，存活率高的虹鳟鱼肝细胞系的建立方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种虹鳟鱼肝细胞系的建立方法，包括如下步骤：

1)组织块培养法：取暂养1d后的试验鱼，用酒精擦拭鱼体进行消毒，随后用高温灭菌后的手术剪从虹鳟鱼的泄殖孔将其腹腔剪开，小心取出肝脏组织，用不含GA2+、MG2+的Hanks液清洗3～4次，洗掉肝脏表面的血污；

2)酶消化法：取材方法同步骤1)，紧接着将组织块剪至1mm3大小组织块后，利用0.1％胶原酶Ⅱ与0.25％胰蛋白酶按体积比1:1混合后进行消化，将消化时间分别设置为5min、10min、15min、20min和40min，消化期间不断摇动组织块，待消化完成时加入等体积的培养液终止消化；

3)肝细胞原代培养基的优化：检测4种不同培养基下细胞的生长能力：DMEM、M199、L15和MEM培养基，设置4个血清浓度梯度5％、10％、15％和20％，每种培养基中加入200IU/mL青霉素、200μg/mL链霉素，分别将大约1.8×105个细胞接种到4种培养基中，于20℃，5％CO2培养箱中分别培养12、24、36和48h；培养12、24、36及48h后用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞在不同培养基条件下的生长曲线；

4)台盼蓝染色：将细胞悬液与0.4％台盼蓝按体积比9:1比例混合，1min后滴于血球计数板上计数，在显微镜下观察，活细胞呈圆形且透明，死细胞被染成蓝色，用活细胞占计数所有细胞百分比表示细胞存活率；

5)CCK-8法：在96孔板肝细胞培养板中，向每孔加入10uL CCK-8溶液，将培养板置于18℃，5％CO2培养箱中孵育4h,然后用酶标仪检测在450nm处的吸光度值；

6)糖原染色：肝细胞爬片用PAS固定液固定15min，用PBS清洗3次、晾干，加入5g/L的过碘酸氧化剂，室温避光氧化20min，氧化后用自来水冲洗2次，蒸馏水浸洗2次，然后加入Schiff Reagent，置于室温避光处浸染20min，加入亚硫酸钠溶液滴洗2次，每次2min，接着用流水冲洗2min，加入Mayer苏木素染色液，复染2min；