[发明专利]一种使用序列k-mer频率优化特征精准识别土壤致病菌污染的方法

说明书

本发明公开了一种使用序列k‑mer频率优化特征精准识别土壤致病菌污染的方法，其步骤为：步骤一、选取合适的k‑mer片段长度，进行频率特征提取；步骤二、对提取的数据进行归一化处理；步骤三、构建交叉融合神经网络；网络由输入层、残差网络、深度网络、交叉网络和特征合并层组成；步骤四、模型预测；第一次使用先训练神经网络参数，再将待预测细菌DNA序列通过步骤一方法提取频率特征，送入训练好的残差神经网络，输出预测结果。本发明准确率优于现有k‑mer特征预测算法；自动地将k‑mer特征组合在一起，高效学习低维特征交叉和高维非线性特征，生成更优的模型。模型不需要人工特征工程或遍历搜索，具有较低的计算成本。

技术领域

本发明涉及生物信息学与土壤生物学领域，具体是一种使用DNA序列的k-mer频率优化特征信息预测细菌致病性，实现土壤中致病菌污染的精准识别检测方法。

背景技术

土壤致病菌(简称致病菌)指在土壤中生存或通过土壤传播的人畜致病菌和植物致病菌，囊括大多数高风险致病菌，如破伤风杆菌、结核杆菌和大肠杆菌等。近年来，新型致病菌的种类和数量日益扩大，加剧抗生素滥用，恶化致病菌耐药风险。致病菌的识别和检测公共卫生、食品安全和动植物检疫检验等领域意义重大。据世界卫生组织统计，由医学致病菌导致的感染性疾病患者死亡人数占全球死亡人数的25％以上，每年约1300万儿童死于感染性疾病。植物致病菌的危害也不容乐观，土传病害爆发加剧土壤生物多样性退化，导致粮食减产或绝收。这些病原菌或在土壤中存活，或通过食物链进行传播，维护公共安全。因此，建立快速灵敏的致病菌检测新技术和新方法迫在眉睫。

当前，致病菌的检测方法种类多，主要分为培养和非培养两类。临床公认的“金标准”是分离培养和生化鉴定，但操作周期长、失败率高，而且很多致病菌难以分离培养。利用PCR扩增技术也可以简单、快速地定量检测致病菌，但需要设计特异性引物，而且只能检测致病菌基因组中的微小序列，缺乏代表性。质谱技术具有灵敏度高、特异性强和可高通量化等特点，被广泛用于致病菌蛋白质、多肽等的研究，但需要针对单一致病菌开展大量培养试验，检测内容也仅限于致病菌的分型。

二代测序技术(NGS)技术已逐步应用于致病菌的检测。NGS检测无需对致病菌进行分离培养，直接检测基因序列，大大缩减检测时间并提高了灵敏度，通过与病原菌数据库进行比对，基于序列相似性来判断样本中所包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)。而对致病菌的基因组测序获得细菌草图和完成图将有助于对致病菌的病理机制和进化动力学进行精细解析研究，快速推进了人类对致病微生物的认知。

然而，当前利用NGS鉴定土壤致病菌仍面临一些问题。数据库缺乏，大部分的病原菌数据库是通过人工筛选整理后获得，数据库中致病菌的类型有限、收录信息存在错误、数据库冗余和更新缓慢等都是常见问题。而随着测序的菌株增多，人类获得的微生物的基因组的序列也越来越多，病原微生的物种类也在不断增多，病原微生物的数据库的全面性始终将会是无法逾越的瓶颈。同时宏基因组测序技术的推进将使人类获取更多的无法培养的微生物的参考基因组，进一步推动基因组学研究深度。而常规的通过数据库注释病原微生物也将不再适用于不断更新的培养及无法培养的微生物基因组，有限的信息制约了致病菌的检测和识别能力，急需建立一种新的不依赖数据库序列比对的快速精确检测方法。

k-mer是指在reads上，从第一个碱基开始，按照1bp为窗口向前移动，截取长度为k的DNA序列切片，常用于基因组组装以及物种基因组大小、杂合度、重复序列、样品污染的评估。随着k-mer的广泛应用，越来越多的基于k-mer算法的软件快速推动了物种的基因组研究，极大丰富了人类对物种起源、进化等方面的认知。然而，k-mer频率衡量基因组中片段的重要性不够全面，无法体现片段或特征间的关联性。因此建立一种全基因组层面k-mer频率交叉融合模型预测细菌致病性，用于精准识别土壤致病菌污染的方法。

发明内容