[发明专利]一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法

说明书

本发明公开了一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法，涉及生物技术领域，可以针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，以断裂点接头序列为切入点，构建置信断裂点筛选模型，揭示扩增子的非线性进化过程和肿瘤耐药克隆进化的全过程，并揭示非同源修复机制介导扩增子的形成，从而为去除肿瘤细胞中DMs的形成或逆转肿瘤耐药提供关键靶点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法。

背景技术

氨甲蝶呤是恶性肿瘤治疗中的第一个有效的抗代谢药，是目前肿瘤治疗中应用最广泛的叶酸拮抗剂，能竞争性地结合二氢叶酸还原酶，抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成，特异性地杀伤增殖期细胞。虽然MTX已成为肿瘤治疗的常用药物，但长时间的用药会导致肿瘤细胞获得耐药性，使治疗效果不佳。DHFR基因扩增，酶水平升高，是导致肿瘤对MTX产生耐药的重要机制。

位于染色体外的双微体(DMs)是基因扩增的主要遗传学标志及主要载体。癌基因和耐药基因以DMs形式发生扩增会导致基因的表达量增高，进而促进细胞的恶性转化、肿瘤恶性进程及耐药。肿瘤的进展及获得耐药的过程是肿瘤基因组进化的过程，然而在肿瘤获得耐药的过程中，DMs是如何从无到有进化演变的，又是如何驱动肿瘤获得耐药的，目前尚不明确。DMs是由扩增子相互连接环化的而成，并与DNA双链断裂(DSBs)修复密切相关，断裂点处连接序列的特征是推断扩增子形成机制的重要依据，然而DMs扩增子在分子水平的形成机制，目前尚不明确。因此亟需一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法来改变这一现状。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法，包括以下步骤：

S1：首先，将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养，待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药后，继续后续实验，HT29亲本及耐药细胞在含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，耐药细胞系培养基中添加相应浓度的MTX，所有细胞均培养在5％二氧化碳、37℃恒温细胞培养箱中；

S2：取数量不超过5×106的生长情况良好的细胞，PBS冲洗3次、胰酶消化并用培养基制备细胞悬液，1000转/分离心5分钟，弃掉上清并用PBS冲洗沉淀，再次离心，弃上清得到细胞沉淀，将细胞沉淀弹开并加入200μl PBS、20μl蛋白酶K和200μl Buffer AL混匀后56℃水浴10分钟，随后加入200μl无水乙醇，涡旋混匀，将液体吸出并加入到QIAmp mini离心柱中，8000转/分离心1分钟后更换收集管，向柱子中加入500μl Buffer AW1离心后更换收集管，条件同上，再加入500μl Buffer AW2,14000转/分全速离心3分钟，将柱子转移至新的1.5ml Eppendorf管中，加适量Buffer AE，室温孵育3分钟后8000转/分离心1分钟，Eppendorf管中离心得到的液体即为基因组DNA，测定DNA浓度并统一配平至50ng/μl；