[发明专利]一种来源于长形芽孢杆菌的水解酶及其修复土壤莠去津污染的方法

权利要求书

1.一种来源于长形芽孢杆菌的水解酶，其特征在于：来源于长形芽孢杆菌生产的TRZN水解酶，是一种三嗪水解酶，编码序列含有1371个核苷酸，所述来源于长形芽孢杆菌生产的TRZN水解酶从s-三嗪环中水解置换氯取代基来引发除草剂莠去津的细菌代谢。

2.一种权利要求1所述的来源于长形芽孢杆菌的水解酶修复土壤莠去津污染的方法，其特征在于：步骤如下：

步骤1：验证转基因的长形芽孢杆菌能够产生TRZN，从Genbank获取金黄色节杆菌TC1三嗪氯水解酶的DNA序列，并用Genscript将其修饰成大肠杆菌，同时添加组氨酸标记以帮助检测和纯化重组蛋白，然后，将这一修改版本克隆到S.Elongatus表达载体psyn1/d-topo中，并通过标准程序将其转化为S.Elongatus基因组的NS1位点，对照分析野生型和转基因长形芽孢杆菌抵抗莠去津的能力，通过测定光合作用，验证TRZN酶对细长S.elongatus细胞免受莠去津危害的保护作用；

步骤2：修改编码TRZN的DNA序列，基于细菌细胞中工作良好的TRZN，修改其DNA序列，使其在植物中发挥作用，允许植物识别从何处开始和停止复制TRZN蛋白，从植物病毒中添加控制序列，利用花椰菜花叶病毒的35S启动子，从rtl2质粒复制并将其直接连接到起始密码子前面，建立植物细胞开始复制蛋白质的指令，同时，通过添加一个植物终止符，指示植物细胞停止复制TRZN，启动子和终止子序列都将通过标准的重组DNA技术添加，由此产生的重组DNA分子将通过标准程序在大肠杆菌中转化和分析；

步骤3：将重组基因转入到拟南芥植株，通过PCR和限制性消化构建正确的结构后，将重组基因转移到长形芽孢杆菌gv3101所含的质粒中，再利用长形芽孢杆菌将其转化为植物细胞，通过花浸法将所需质粒引入拟南芥植株，将获得的转基因种子播种在含有50mg/ml卡那霉素的琼脂平板上进行鉴定，并利用检测转基因的引物进行PCR验证，确认转基因植物通过标准程序制造出TRZN蛋白；

步骤4：评估转基因植物抵抗莠去津毒害的能力，在莠去津的存在下，通过比较转基因植物与野生植物的光合速率测试莠去津是否影响光合作用，用氧电极和Licor LI-6400光合作用监视器测量相同浓度的莠去津，同时，比较用莠去津处理的转基因植物和野生型植株的叶绿素荧光参数，评估目标植株与对照植株抵抗莠去津毒害的能力；

步骤5：测试转基因植物降解莠去津的有效性，通过评估转基因植物抵抗莠去津毒害的结果表明转基因植物受到了莠去津的保护，进一步通过薄层色谱法和高效液相色谱法在植物中寻找羟莠去津，并验证转基因植物的提取物是能够在体外将莠去津转化为羟莠去津；

步骤6：转基因拟南芥植株抗性验证，然后通过野生型和转基因型植株的耐受性对比实验，将两种株型移栽到含有0.5mg/kg莠去津的土壤中，2周后的结构显示与转基因植株相比，野生型明显受到抑制，株高和地上部生物量明显降低，根系不生长，叶片数量减少，而转基因型植株受到抑制较小，结果表明TRZN酶显著提高了拟南芥植株对莠去津毒害的耐受性。