[发明专利]一种林麝香囊腺细胞培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，且公开了一种林麝香囊腺细胞培养方法，包括以下工作步骤：第一步：取材；第二步：消化；第三步：单细胞制备分离；第四步：原代培养；第五步：传代培养。第六步：冷冻保存和复苏；第七步：细胞增殖检测；第八步：镜检；第九步：代谢物检测。本发明中，取出泌香盛期林麝香囊腺组织，置入含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗、去除外膜和结缔组织；用无菌眼科剪将组织剪碎后加入Ⅳ型胶原酶于37℃消化5h后再加0.25mg/mL胰蛋白酶消化约15分钟。用DMEM培养基终止消化，消化液过滤后于600r/min离心3min，弃上清，将获得的细胞悬液加入完全培养基中再次离心，重复3次，收集分散的细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种林麝香囊腺细胞培养方法。

背景技术

林麝，为麝科麝属动物，在中国主要分布于宁夏六盘山、陕西秦岭山脉，东至安徽、湖南，西至四川、西藏、云南，南至贵州、广东及广西，其以树叶、杂草、苔藓、嫩芽、地衣及各种野果为食。成年林麝体重6～9kg，体长630～800mm，雌、雄麝都不长角，雄麝的上犬齿发达，长而尖，露出口外，呈獠牙状。尾巴很短，四肢细长，蹄子比较狭而尖，耳朵长而直立；毛粗硬、曲折呈波浪状，呈深棕色，成体不具斑点。

麝香长在麝鹿成熟雄体的肚脐和生殖器之间的香囊腺体中，香囊腺由麝香分泌腺与麝香囊两部分组成。麝香分泌腺属复管泡腺,是分泌麝香液，产生麝香的组织。麝香囊是浓缩麝香液，贮存麝香的处所，覆盖麝香腺的皮肤，有汗腺及皮脂腺，二者开口于皮肤外表，麝香囊颈部只有皮脂腺。麝香分泌腺的排泄管，开口于麝香囊颈部皮脂腺间，毛干上端，或直接开口于颈部表皮，进入麝香囊。

传统名贵中药材麝香是成年雄麝香囊中的干燥分泌物，由于其重要基原动物林麝的数量稀少，且单产极低，造成麝香资源供不应求。国家严格限定天然麝香仅用于安宫牛黄丸、六神丸、八宝丹、片仔癀、醒脑静注射液、麝珠明目滴眼液、西黄丸的制备，但目前麝香的产量仅能满足市场需求的0.5～2％。

细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，而且细胞培养本身就是细胞的克隆，细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术。通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢等分子机制。为采用细胞工程学方法大量生产麝香做理论铺垫，也对国家一级保护动物林麝的资源保护和综合利用有积极的促进作用。

为此，我们提出一种林麝香囊腺细胞培养方法。

发明内容

本发明主要是解决上述现有技术所存在的技术问题，提供一种林麝香囊腺细胞培养方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案，一种林麝香腺上皮细胞培养方法，包括以下工作步骤：

第一步：取材；

第二步：消化；

第三步：细胞制备；

第四步：原代培养；

第五步：传代培养；

第六步：冷冻保存和复苏；

第七步：细胞增殖检测；

第八步：镜检；

第九步：代谢物检测。

作为优选，所述第一步，切取林麝香囊腺组织，剪下一小块置入含有青霉素-链霉素的PBS中清洗、去除外膜和结缔组织。

作为优选，所述第二步，将第一步切取的材料剪碎后加入Ⅳ型胶原酶后于37℃消化5h后再加0.25mg/mL胰蛋白酶消化约15分钟。