[发明专利]一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用

说明书

本申请公开了一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用。本申请的RSPO1检测稳转细胞株为人胚胎肾细胞De‑RSPO‑CS，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C202224。本申请的RSPO1活性检测稳转细胞株，De‑RSPO‑CS为RSPO1蛋白功能测试及相关分子机制研究提供了一种新的研究工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

R-脊椎蛋白(R-Spondin，RSPO)蛋白家族是含有血小板反应蛋白质1型重复序列(thrombospondin type1 repeat,TSR-1)的超家族。其家族有4个成员，分别为R-spondin1～4(RSPO 1～4)；它们的氨基酸序列同源性为40％～60％，且均含有1个羧基尾巴和2个富含半胱氨酸的弗林蛋白质酶域(furin-like cysteine-rich domains,FLD)。RSPOl被认为是一种崭新的内皮细胞分裂素，能够刺激黏膜的生长。实验显示，由DSS、TNBS等药物在小鼠肠道引发的急性或慢性炎症，可以通过注射RSPOl蛋白来改善，RSPOl通过调节Wnt/β-catemin信号通路刺激隐窝上皮细胞生长和黏膜再生以保持黏膜完整性，令肠道结构得到修复，从而使炎症带来的小鼠体重减轻、腹泻、直肠出血等症状得到减轻。与此相似的是，肿瘤小鼠在接受化学治疗或放射治疗时，RSPO同样可以通过刺激内皮细胞增殖使化疗药物和放射物对黏膜造成的损伤得到修复，从而保护正常组织免受毒副作用的影响，提示RSPO具有作为抗癌辅助药物的潜力。以上发现暗示RSPO在某些肿瘤的治疗中具有相当的潜力，有望成为新型的抗肿瘤基因治疗药物。

另有研究报道，RSPOl及其同源蛋白可作为配体特异性激活孤儿受体LGR5，并激活Wnt信号通路。而Wnt/β-catenin信号通路在细胞极性产生和细胞命运决定中发挥重要作用，包括通过干细胞群体进行的自我更新，进而影响生物体的组织分化，器官形成以及疾病发生。近年来，随着干细胞培养技术，特别类器官培养技术的兴起，RSPO-1作为培养基中的主要组成部分，也愈发凸显其重要性。

RSPO1的蛋白表达和纯化是满足其在干细胞培养和组织修复应用的必要途径。但纯化后的蛋白活性的定性和定量检测仍存在诸多问题：1)缺少特异性响应RSPO1的靶向序列；2)瞬时转染的细胞批次不稳定，影响RSPO1的定量检测。本发明构建了一株能够检测RSPO1稳定表达的细胞株，可以稳定的测试RSPO1蛋白的活性，为RSPO1的应用提供了技术保障。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用，解决了上述背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种RSPO1检测稳转细胞株，命名为人胚胎肾细胞De-RSPO-CS，于2022年1月20日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202224，地址为中国武汉，武汉大学。

本发明提供的人胚胎肾细胞De-RSPO-CS是通过以下方法进行构建：

S1.慢病毒载体pHS-AVC进行线性化处理后与测试RSPO1活性的元件序列进行连接形成终载体；

S2.终载体进行病毒包装，形成过表达慢病毒包装产物；

S3.过表达慢病毒包装产物感染293FT细胞，筛选，即得到RSPO1检测稳转细胞株。

本发明还提供了人胚胎肾细胞De-RSPO-CS的子代细胞。

本发明还提供了人胚胎肾细胞De-RSPO-CS及其子代细胞的用途，包含以下一项或多项：

a.用于RSPO1蛋白功能测试；

b.用于研究Wnt信号通路相关分子机制；