[发明专利]抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒及其制备和应用

说明书

本申请提供了抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒及其制备方法，其中所述RNAi所用核酸针对Slc2a1上的3个干扰位点设计。本申请的腺相关病毒能显著特异性抑制小胶质细胞Glut1的表达；明显改善应激引起的小鼠空间学习记忆功能障碍；能够抑制应激诱导的小胶质细胞M1极化，降低海马区炎症因子的含量；进而应用于治疗应激性学习记忆障碍、神经炎症等疾病。

技术领域

本申请属于生物技术领域和基因治疗领域，具体地，本申请提供了抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒及其制备和应用。

背景技术

随着现代社会生活节奏的加快和社会竞争的加剧，多数人都处在不同程度的应激负荷之下，长期过度应激已被确认为人类多种重大致死性疾病的重要推动因素，人类约70％的疾病的发生发展与机体应激损伤密切相关。大脑是机体感应和应对应激的调控中枢，同时也是应激易损伤的靶器官，尤其是涉及高级脑活动的认知功能在面对应激时显得尤为脆弱。流行病学调查显示，长期处于应激状态的人群其轻度认知障碍和痴呆的患病率是同年龄非应激人群的两倍以上。海马是空间学习记忆能力的关键调控脑区，应激可引起海马结构和功能的改变，包括海马体积缩小、椎体细胞树突棘数量减少、突触可塑性异常、齿状回神经发生受阻等，从而引起空间学习记忆障碍。但由于应激诱导空间学习记忆损伤的分子机制仍不清楚，目前临床上尚缺乏针对应激性空间学习记忆障碍的有效防治药物。

研究表明，应激过程中脑内炎性因子增多，由此导致的神经炎症样改变可能是应激造成学习记忆障碍的重要原因之一。小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫细胞，是脑内炎症的最主要贡献者。小胶质细胞在生理状态下呈现静息状态，发挥免疫监视作用；而当受到外界刺激时可发生两种极化，分别促进或抑制炎症反应，调节免疫平衡。其中发生M1型极化的小胶质细胞大量分泌炎性因子，包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)等；M2型极化的小胶质细胞则会上调IL-10、CD206等介质发挥抗炎作用。事实上，小胶质细胞M1极化相关的神经炎症被证明与包括阿尔茨海默病在内的多种认知功能损害密切相关，但目前关于小胶质细胞发生M1型极化的调节机制尚不明确。

在阿尔茨海默病、糖尿病乃至各种应激相关疾病当中，包括神经系统在内的各组织器官低烈度炎症往往和代谢异常关系密切，炎症和代谢之间的相互作用也被认为是这些疾病发生发展的共同土壤。我们研究发现应激诱导的神经炎症样改变伴有脑组织内部葡萄糖水平升高和小胶质细胞葡萄糖转运体Glut1的上调。Glut1蛋白由基因Slc2a1编码，是糖代谢的重要调节因子。我们研究发现人为特异性抑制小胶质细胞Slc2a1的表达可以显著降低小胶质细胞的M1型极化，减少神经炎症的发生，并改善应激性空间学习记忆障碍。小胶质细胞Glut1在应激性认知障碍中的作用迄今未见报道，目前也未见有通过靶向小胶质细胞Glut1来治疗应激性认知障碍的相关技术。

基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体是基因治疗中常用的病毒载体，它具有安全性良好、宿主范围广、感染效率高、制备方便且易纯化浓缩等特点，其独特的优势使其在基因治疗中具有广泛的应用前景。目前已有研究证实，以腺相关病毒为载体的基因治疗方法在遗传性视网膜疾病、脊髓性肌萎缩症等多种疾病的治疗中安全有效。

发明内容

针对上述问题，本申请制备了miR(microRNA)RNAi的特异性靶向Slc2a1的腺相关病毒(AAV-mirSlc2a1)，AAV-mirSlc2a1能显著特异性抑制小胶质细胞Glut1的表达；将AAV-mirSlc2a1注射至应激小鼠的海马区，能够明显改善应激引起的小鼠空间学习记忆功能障碍；进一步的，AAV-mirSlc2a1能够抑制应激诱导的小胶质细胞M1极化，降低海马区炎症因子的含量。

一方面，本申请提供了一种抑制Slc2a1的RNAi腺相关病毒，所述腺相关病毒中克隆有针对Slc2a1设计的miR RNAi核酸。