[发明专利]一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法

说明书

本发明公开了一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法，包括以下步骤：选择黄心夜合休眠期的顶芽作为外植体，进行预处理，将其浸泡于0.01g/L的PVP溶液且于4℃下暗处理4～5d后进行清洗；用酒精及NaClO溶液对预处理后的外植体进行消毒灭菌，得到黄心夜合无菌外植体；将无菌外植体接种到初代培养基上进行培养，初代培养基中添加了抗褐化剂PVP和VC；本发明通过对外植体取材、外植体预处理、灭菌处理、培养基中激素配比进行优化，将污染率与褐化率有效降低至4.17％和47.22％，解决了黄心夜合初代培养污染率、褐化率高的难题，且操作简单，成本低廉。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种降低黄心夜合外植体污染和褐化的初代培养方法。

背景技术

黄心夜合(Michelia martinii)是木兰科含笑属植物，树干通直，树形丰满紧凑，叶色光亮，叶型秀丽，花芳香，淡黄色，秋季果熟，红艳夺目，可用于城市行道树或公园、庭院布置，也可提炼芳香油，具有观赏价值和用材价值。黄心夜合自然分布于我国河南南部、湖北西部、四川中部和南部、贵州、云南东北部。该种列入1999年8月4日批准的《国家重点保护野生植物名录(第一批)》：II级；列入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》(IUCN) ——近危(NT)。

木兰科植物作为多心皮类植物的典型代表，是探索被子植物起源、发展演化和建立被子植物自然系统不可缺少的的关键材料；同时，木兰科植物是热带至温带常绿阔叶林和落叶阔叶林的重要组成成分，具有举足轻重的生态价值，又是园林观赏、工业用材、药材和香料树种，具有经济价值。然而，当前被广泛应用的木兰科植物仅限于木兰属、含笑属和木莲属中的小部分种类，相对于我国丰富的木兰科种质资源来说，开发利用程度仍然不够。

在自然条件下，木兰科植物由于雌雄异株，两性花但雄蕊早落或雌雄花花期不同等原因使得自然繁殖能力很差；种子繁殖中，有些种类的发芽率较低，有些种类分布地域狭窄、种子来源有限；常规无性繁殖中，扦插繁殖存在生根困难的问题，嫁接繁殖受嫁接方式及嫁接时间的影响，对操作人员技术要求较高。而组织培养与传统的繁殖方式相比，受季节和环境条件等因素的影响较小，具有繁殖速度快、繁殖系数大的优点，可以实现工厂化育苗，是木兰科植物资源开发与利用的有效途径。目前已有不少关于木兰科植物组织培养的报道，但还没有关于黄心夜合组织培养的研究。

在木兰科植物组培的过程中，污染与褐化现象普遍存在。外植体的褐化影响了多种木兰科植物芽体的萌发、愈伤组织的增殖与分化(苏梦云，姜景民.乐东拟单性木兰茎段愈伤组织诱导与褐变控制的研究[J].林业科学研究，2004(06)：757-762.；刘均利，马明东.华盖木组织培养中褐化控制研究[J].浙江林业科技，2007(01)：20-23+32.)，导致组培的效率不高，限制了组培苗大规模的生产(周丽艳，郭振清，秦子禹，苏孟立.白玉兰组织培养中的褐化控制[J].河北科技师范学院学报，2008，22(04)：19-22.)。前期对于黄心夜合组织培养的预实验中发现，外植体存在严重的污染和褐化现象，阻碍了快繁体系的建立。

木兰科外植体的消毒多于生长季采用顶芽、茎段外植体，以0.1％的升汞溶液消毒。但是，升汞对于环境的污染大，废液难以回收处理。同时，汞离子在杀灭微生物的同时，也会对外植体造成伤害。消毒时间越长，外植体污染率越低，但是外植体褐化率升高。

目前一般认为植物组织培养中的褐化是酶促褐化，酶、底物和氧是酶促褐变的必要条件，酚类物质是外植体酶促褐变反应中的底物，多酚氧化酶(PPO) 是普遍认可的诱发褐化的酶。在正常的组织细胞内，酚类物质分布在液泡内， PPO分布在各种质体或细胞质内，两者不接触。在建立外植体时，切口附近的细胞受到伤害，酚类与PPO的分隔被打破，两者接触，酚类物质在PPO的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，对外植体产生危害。前人通过外植体类型、采条季节的选择、外植体的预处理方式、添加抗氧化剂、暗培养等多种技术抑制褐化。

在利用黄心夜合组织进行离体培养时，如何在控制污染的同时抑制其褐化，以提升离体培养的成功率和效率，成为黄心夜合野生资源开发与利用过程中亟待解决的技术难题。