[发明专利]一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用

说明书

本发明公开了一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用。该细胞系名称为PMC‑3，保藏编号为：CGMCC No.23099。该细胞系第60代的细胞仍保持原代细胞的形态特征，核型分析表明连续传代后细胞没有发生染色体变异。该细胞系对猪乙型脑炎病毒高度易感，接毒后72h，细胞病变达到70％～80％，收获的病毒液病毒含量为10^7.5PFU/ml，比Vero细胞培养的猪乙型脑炎病毒相比，具有收毒时间快、效价高的特点。同时该细胞系还可以用于猪瘟病毒和流行性腹泻病毒的培养及流行性腹泻病毒的分离等，具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用。

背景技术

猪乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。蚊子是乙型脑病毒的主要传播媒介。猪是乙型脑炎病毒的重要储存宿主和扩增宿主，是乙型脑炎的主要传染源。猪乙型脑炎主要变现为怀孕母猪繁殖障碍，公猪睾丸炎。目前，我国用于预防猪乙脑感染的疫苗主要是经鼠脑组织培养制备的灭活疫苗、地鼠肾原代细胞和Vero细胞制备的灭活疫苗。鼠脑组织和地鼠肾原代细胞制备的疫苗，在生产中存在实验动物来源紧张、生产成本高、产量低、外源因子多、批次差异大等缺点。Vero细胞制备的灭活疫苗解决了生产成本和稳定性问题，但是Vero细胞为非猪源细胞，存在外源因子污染的问题，对疫苗的品质存在一定的缺陷。基于地鼠肾原代细胞和Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)对乙脑的病毒的生产应用，目前国内外尚未有猪源性肾细胞在乙脑病毒上的研究，为了克服现有技术的不足之处，寻找到一株适合乙脑病毒繁殖的猪源性肾细胞将为猪乙脑的防控带来积极的影响。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术空白，建立一种自发永生化的猪原代肾小球系膜细胞系，并将其应用于猪乙型脑炎病毒的培养中，为猪乙型脑炎疫苗原代细胞生产方式提供技术储备。同时还可将该细胞系应用于猪瘟病毒和流行性腹泻病毒的培养。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供的一种胎猪肾小球系膜细胞系，名称为PMC-3，分类名称为胎猪肾小球系膜细胞，已经于2021年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.23099。

胎猪肾小球系膜细胞PMC-3CGMCC No.23099通过下述方式得到：

剖腹取怀孕90日龄的胎猪，取出完整的肾脏置于PBS溶液中，将肾脏浸泡于酒精中消毒2min，然后转移至PBS溶液中清洗3次。小心剥离被膜血管等多余组织，将肾脏纵向切开，去除肾脏髓质血管等中间白色组织。将剩余组织用眼科剪剪碎，加入1mlPBS后继续剪成碎块，用1ml断枪头转移至50ml离心管，然后用PBS反复清洗3次去除血细胞，至洗液澄清。将组织块少量多次转移至80目筛网，用注射器活塞塑料平端仔细研磨，边研磨边用PBS冲洗，将滤出液用100目网筛过滤。将过滤的液体转移至50ml离心管，1500r/min离心10min，弃上清，用0.05％～0.1％I型和0.05％～0.1％IV型胶原酶重悬肾小球，消化40min～1h。用100μm细胞筛网过滤消化液，然后1500r/min离心5min。弃上清，用细胞生长培养基(DMEM/F12+10％FBS+1％双抗)重悬细胞，视细胞量铺T25细胞培养瓶，每瓶5ml培养液，置于培养箱中进行培养。在倒置显微镜下观察，细胞在24h即有少量贴壁，补加2ml培养液，贴壁培养48h-72h增殖明显，进行换液培养。细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，PBS洗三遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，使用细胞生长培养基终止消化，细胞按照1:2的比例进行传代，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。