[发明专利]一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法

说明书

本方案属于荧光纳米材料制造领域，涉及一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法。该探针对溶剂极性敏感，具有单、双光子荧光特性。可免洗实现细胞内脂滴的快速成像。具体是将N,N‑二乙基对苯二胺与无水乙醇所形成的溶液在反应釜200℃条件下进行12h的溶剂热反应，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，后经旋转蒸发得到碳点类荧光探针。该探针量子产率高、稳定性好、生物相容性优异；在疏水性的油性介质里表现出极高的荧光强度，而在水环境中荧光得以淬灭，可实现脂滴的特异性成像。本发明所制备的纳米探针具有免洗特性，简化了细胞处理步骤，可实现成像信号与背景的高反差。可用作生物宽场成像、共聚焦成像、超分辨荧光成像等。

技术领域

本方案属于荧光纳米材料制造领域，涉及一种活细胞内脂滴特异性靶向的纳米探针的制备方法和使用方法，尤其涉及一种兼具上下转换荧光性质，可以匹配共聚焦成像和双光子荧光成像系统的环境敏感的、免洗的碳点探针。

背景技术

脂滴(LDs)是由中性脂质核心组成的脂质储存细胞器，主要包含胆固醇酯和甘油三酯，由磷脂单层外壳覆盖。脂滴主要存在于真核生物的脂肪组织中，也存在于其他类型的细胞中，因为脂滴参与了不同的细胞过程，如膜形成、运输和蛋白质-蛋白质相互作用等，故在调节细胞脂质代谢中起着非常重要的作用而受到了广泛关注。此外，脂滴功能的失调会导致代谢紊乱，如肥胖、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化等。为了探究脂滴在不同代谢紊乱中的作用，了解脂滴与其他细胞器之间的相互作用，发展可靠、实时、高保真的脂滴成像方法和探针是非常重要的。细胞脂滴的可视化可以通过多种成像和谱学方法来实现，例如传统的透射光显微镜、拉曼显微镜和质谱法等。这些先进的技术使人们能够研究细胞脂滴的相关信息，但它们需要复杂的样品制备和数据分析。此外，上述方法通常需要固定细胞或提取脂滴，忽略了研究细胞自身环境中脂滴的实时动态变化的特性。另一方面，荧光成像技术由于其高灵敏度，已被证明是研究复杂生物过程的有力方法，广泛应用于细胞相关生理过程的研究。

然而，目前用于脂滴的荧光探针(包括尼罗红和BODIPY 493/503)具有局限性。首先，尼罗红非特异性的细胞器靶向性，导致对脂滴具有较低的选择性。此外，尼罗红因其在细胞中的宽发射光谱而不适合多色成像。而BODIPY 493/503也由于其短斯托克斯位移和低的光稳定性不利于脂滴的成像研究。

双光子荧光是分子本身吸收两个光子后到达激发态能级，落回至基态过程中而发射出荧光的一种上转换发光现象。因其具有较长的激发波长，因而将生物体本身荧光和光损伤降低到最小。基于这种原理开发出的双光子显微镜(TPM)可以在成像生物样品的同时获得内在深层组织区域高分辨率图像。此外，具有双光子荧光特性并具备脂滴靶向性的探针为研究脂滴与其他细胞器互作、脂滴生成机制及其在细胞内动态变化提供了可能。因此，开发多色、低毒性、高靶向性、具有双光子特性的脂滴选择性荧光探针。是监测脂滴相关的生理过程的迫切需求。

碳点(CDs)，通常是指尺寸介于纳米尺度、具有荧光性质的含碳纳米颗粒。荧光碳点的结构一般是sp²、sp³碳的杂化结构,一般具有明显的晶格结构。由于具有合成工艺简单、光学性能优异、发光可调、生物相容性好等诸多优点，近来引发了人们的广泛关注。得益于其显著的优势，碳点被广泛应用于生物传感、细胞成像、光电催化等领域。然而，目前对于其光学性能的调控，尤其是开发具有双光子特性的碳点报道较少，具有一定挑战性。碳点另的一个优点是其良好的细胞内滞留能力，目前已经开发出多种细胞器靶向的碳点，如溶酶体、线粒体、细胞核等，允许对靶标物质进行连续和长期的跟踪。这种新型的荧光探针为长时间研究脂滴、脂滴与其他细胞器互作、脂滴生成机制及其在细胞内动态变化提供了可能。然而，目前针对脂滴特异性靶向的碳点报道较少。

发明内容

本发明涉及一种细胞内脂滴特异性靶向的纳米探针的制备方法和用途。同时，该探针具有双光子荧光特性，可以在780nm皮秒激光激发下、免洗的实现活细胞内脂滴的高质量成像；且具有量子产率高、稳定性好、生物相容性优异、操作简单的优点。其优势是可以免洗，与背景信号相比，具有更高的成像反差。