[发明专利]CRISPR/cas9系统在获得番茄潜叶蛾犬尿氨酸3-羟化酶突变型方面的应用

说明书

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及CRISPR/cas9系统在获得番茄潜叶蛾犬尿氨酸3‑羟化酶突变型方面的应用。本发明提供了上述番茄潜叶蛾犬尿氨酸3‑羟化酶基因cinnabar的应用。对番茄潜叶蛾蛾靶基因突变，结果显示，CRISPR/Cas9诱导靶基因突变后，番茄潜叶蛾眼睛颜色变为红色或棕褐色，说明cinnabar基因在番茄潜叶蛾的眼黄素生物合成中起关键作用。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及CRISPR/cas9系统在获得番茄潜叶蛾犬尿氨酸3-羟化酶突变型方面的应用。

背景技术

番茄潜叶蛾Tuta absoluta，属鳞翅目，麦蛾科，又名番茄麦蛾、番茄潜麦蛾、南美番茄潜叶蛾，是番茄的重要害虫。南美番茄潜叶蛾主要以幼虫进行危害，雌性成虫喜欢在刚刚展开的叶片上进行产卵，幼虫一经孵化便潜入寄主植物的组织中，潜食叶片。目前防治该虫，使用化学农药是最主要措施只要，随着化学农药的持续使用，促使其抗药性不断增强，并迅速的对各种药剂靶标产生抗性。

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatedproteins)是生物体在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。通过人工设计形成具有引导作用的sgRNA(singleguideRNA)，以引导Cas9对RNA、DNA和蛋白的定点切割，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA。已有研究结果表明CRISPR-Cas9技术是一种可靠、高效、快速的基因敲除的新方法，且可以在不同的位点同时引入多个突变。利用CRISPR/Cas进行基因编辑可达到持久稳定的效果，是一种有效的研究基因功能的遗传工具。使用表型特征明显的功能基因作为靶标研究是快速辨别CRISPR/Cas技术是否构建成功的重要途径之一。

昆虫眼黄素的合成路径主要是由色氨酸经犬尿氨酸途径生成。色氨酸首先在色氨酸加氧酶的作用下将吡咯环打开，生成甲酰犬尿氨酸；然后在犬尿氨酸甲酰胺酶作用下，甲酰犬尿氨酸甲酰脱甲基生成甲酸和犬尿氨酸；犬尿氨酸在犬尿氨酸3-羟化酶基因cinnabar作用下生成3-羟基犬尿氨酸，其是眼黄素合成的直接前体。因此，犬尿氨酸3-羟化酶基因cinnabar是昆虫眼黄素合成路径中的一个关键基因。

发明内容

本发明目的提供一种番茄潜叶蛾犬尿氨酸3-羟化酶。

本发明的再一目的是提供番茄潜叶蛾犬尿氨酸3-羟化酶基因。

本发明的再一目的是提供包括上述番茄潜叶蛾犬尿氨酸3-羟化酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供上述编码基因在番茄潜叶蛾眼黄素合成路径中的应用。

根据本发明的具体实施方式，首次克隆出番茄潜叶蛾犬尿氨酸3-羟化酶基因cinnabar，其cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：