[发明专利]一种人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白与抗体的制备方法

说明书

一种人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白与抗体的制备方法。N端特异性多肽氨基酸序列为：NYAPPETEDVSNRNC。抗人精子膜蛋白SPACA1抗体制备包括：（1）特异性胞外抗原表位分析与设计；(2)特异性人工多肽合成；（3）合成多肽与载体蛋白交联；（4）制备兔多克隆抗体；（5）收集、分离、纯化获得抗体。本发明制备的特异性抗人精子膜蛋白SPACA1抗体效价高、亲和力强、特异性好，可在体内和体外与具有天然活性的人精子膜蛋白SPACA1抗原表位发生特异性结合，可用于荧光免疫和酶联免疫吸附实验。该抗体不仅对研究人精子膜蛋白SPAG8蛋白特性、功能、表达谱和相关疾病提供一个重要工具，还在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有应用前景。

技术领域

本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，该抗体是用于人精子膜蛋白SPACA1蛋白的基础研究的重要工具，还可在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有很好的应用前景。

背景技术

精子获能是两性生殖过程的重要步骤，获能过程中精子细胞膜从非生育状态转化到生育状态。当精子获能后，精子膜蛋白、糖蛋白、脂质成分和精子质膜通道发生多种分子结构的变化，一方面出现精子头部质膜成分损失，尾部细胞膜改变，发生精子超活化；另一方面精子对卵细胞及其相关结构(颗粒细胞，卵透明带)提供的信号进行反馈并发生顶体反应(AR)。出现顶体受体的激活、顶体膜与精细胞质膜融合、顶体中水解酶的释放、卵细胞外被(透明带)的水解等过程，最终促进精子-卵母细胞融合。精子顶体区上的这些受体、糖或蛋白质分子可以作为抗原直接产生抗精子抗体(AsAb)，从而妨碍精卵融合，引发男性不育。由于缺乏精子顶体膜蛋白特异性抗原位点和抗体的研究，AsAb引起男性免疫不育症的作用机制尚未明确，因此借助分子生物学、生物信息学和高通量测序等技术的跨学科应用，进一步揭示精子顶体区、颈部和尾部精子表面膜蛋白的特异性抗原位点在两性生殖过程中的作用机制，构建特异性免疫不孕不育靶向治疗方法等一系列的科学问题，是促进健康生育、构筑人口安全的重大需求。

(1)SPACA1的功能：人精子顶体膜相关蛋白1(sperm acrosome membrane-associated protein 1，SPACA1)基因位于6q15DNA正义链，长度为19,798bp，有8个外显子，具有一个保守结构域，该基因的mRNA有两种亚型：XM_011536160.2和XM_017011335.1。SPACA1蛋白质产物294个氨基酸，分子量32,143Da，是单次跨膜Ⅰ型膜蛋白，主要位于细胞膜。在精子发生过程中，在精子细胞发育的所有阶段的顶体中都能检测到SPACA1，但在顶体形成之前未发现。该蛋白定位于精子细胞和成熟精子的整个顶体的内膜和外膜。有研究显示SPACA1主要在顶体形态发生和精卵结合及融合中起作用。

(2)SPACA1抗体产品的信息：经检索,市场上有SPACA1蛋白的多克隆抗体,但是这些抗体的抗原表位不同且只能进行体外检测。

(3)SPACA1抗体的功能：SPACA1抗体与特发性不孕不育病例具有相关性，该基因表达的蛋白最早通过不育男性的抗精子抗体识别。体外实验显示SPACA1在精子与卵膜结合与融合中发挥生理作用，SPACA1重组蛋白产生的抗体可以抑制人类精子与去透明带仓鼠卵的结合从而阻断体外受精。重组SPACA1抗原与抗精子抗体阳性的不育男性血清有强烈的免疫结合反应，提示SPACA1可能是引起免疫不育的抗原。动物实验显示，SPACA1蛋白在精子头部的形成中起着重要作用，SPACA1基因敲除小鼠的成熟精子是缺乏顶体的圆头精子能够引起不育。

发明内容

本发明目的针对可用于免疫不育机制研究的AsAb制备方法和研究工具的不足，提供一种人精子膜蛋白SPACA1特异性多肽、抗原偶联蛋白与抗体的制备方法，不同于体外实验检测抗体，用此多肽制备的抗SPACA1抗体一方面可以通过免疫荧光和酶联免疫吸附实验特异识别组织或细胞中的天然人SPACA1蛋白，另一方面可以借助SPACA1的特异性表面抗原位点进行抗精子抗体介导的免疫不育作用机制的研究，还可以开展靶向示踪、生物制药和精准治疗等方面的研究。

本发明的技术方案