[发明专利]白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法

权利要求书

1.一种白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法，其特征在于，具体调节方法包括以下步骤：

S1、原发性肝癌标本收集和肿瘤相关巨噬细胞分离，用剪刀将人新鲜肿瘤样品切碎，分离和培养巨噬细胞；

S2、外泌体分离和纯化，用试剂盒提取外泌体，用红色荧光接头PKH26标记纯化的外泌体；

S3、透射电子显微镜观察的外泌体和TAMs细胞；

S4、RNA分离和qPCR，使用Trizol试剂从细胞或小鼠组织中分离总RNA，然后使用实时qPCR和实时荧光定量PCR试剂盒分析RNA；

S5、Western blot蛋白分析，外泌体或细胞在含有蛋白酶抑制剂的RIPA中裂解，总共20μg的外泌体通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜，然后将膜与抗体CD63、Calnexin、PCNA、细胞周期蛋白D1、E-cadherin、N-cadherin、微管蛋白、Bax、Bcl-2、MMP-2和MMP-9孵育过夜；

S6、CCK-8和EDU测定增殖

S7、通过流式细胞术定量细胞凋亡；

S8、迁移测定和滑痕分析；

S9、实验动物异种移植小鼠模型，将处于对数生长期的QJY-7703细胞制备成细胞悬液，腋窝皮下注射细胞(5×10⁵)BALB/c裸鼠，4-6周龄，每组n＝6，待瘤体肉眼可见时，每2天尾静脉注射外泌体，共7次，10天后每5天测量一次肿瘤体积，直到30天后处死小鼠；

S10、肝肺转移实验；

S11、TUNEL染色；

S12、生物信息学分析和结果。

2.根据权利要求1所述的白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤为：

S1-1、准备无菌饭盒，内放置盛有无血清DMEM液的培养皿；

S1-2、用剪刀和手术刀片剔除可见的大血管和单管结构以去除内皮细胞的污染，剔除坏死组织、结缔组织和血液等杂物，用PBS洗涤三次；

S1-3、在10cm培养皿中用剪刀和手术刀片将组织切碎后，组织块浸入含0.1％1V型胶原酶的无钙无镁Hank’s平衡盐溶液中，放入37℃的二氧化碳培养箱中消化40分钟，每隔5分钟用吸管捶打一次使细胞分离：

S1-4、利用钝器机械研磨组织以剔除内皮细胞；

S1-5、得到的细胞悬液经75pm尼龙薄纱滤网：

S1-6、滤液4℃下70g转速下离心3分钟两次以去除肝实质细胞，得到肝非实质细胞；

S1-7、PBS清洗上清液中的肝非实质细胞，4℃下650g转速离心7分钟；

S1-8、细胞沉淀PBS重悬，在25％和50％Percoll细胞分离液中离心15分钟，温度为4℃，转速为1800rpm；

S1-9、收集最上层细胞组分，加入红细胞裂解液，经PBS清洗两次，得到巨噬细胞；

S1-10、巨噬细胞纯度经流式细胞术检测CD68阳性率，肝癌细胞为Huh7,HepG2 andQJY-7703，肿瘤细胞系外购，在收集上清液之前，接着用20ng/mlIL-2孵育处理TAM 24小时。