[发明专利]一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用，属于免疫学和肿瘤治疗学领域。所述CAR巨噬细胞包括α1β1整合素跨膜区及胞内信号调控基序、FcγRⅠ胞内信号转导基序、胞外抗原结合区，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑4所示。本发明还将基于α1β1整合素介导FcγRⅠ胞内信号传导域构建CAR巨噬细胞，通过试验证明了该CAR巨噬细胞激活巨噬细胞活化信号并促进巨噬细胞吞噬能力，协同增强抗肿瘤效应。本发明通过设计适用于巨噬细胞信号转导功能的特异性元件，构建了真正意义上的CAR巨噬细胞技术平台，为今后广泛适用于各种CAR巨噬细胞治疗实体肿瘤的应用及延伸设计。

技术领域

本发明涉及免疫学和肿瘤治疗学技术领域，特别是涉及一种α1β1整合 素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用。

背景技术

免疫治疗在肿瘤治疗领域发挥重要作用，且不断取得重要进展。近年 来，CAR-T细胞疗法因其在血液系统肿瘤领域取得的很好疗效，现已被美 国FDA及我国药监部门批准成为特定血液癌症治疗的临床用药。然而， CAR-T细胞疗法因受到T细胞对实体肿瘤浸润难度大、以及T细胞在肿瘤 微环境中遭遇免疫衰竭等问题。迄今为止，CAR-T细胞疗法在针对恶性实 体瘤的治疗中进展缓慢。当前探索更多类型免疫细胞用于开发过继细胞疗 法，以能开展特定有效的细胞免疫治疗已成为肿瘤免疫治疗发展的热点和 趋势。巨噬细胞先天具有肿瘤趋化性，并可深度浸润实体肿瘤，部分肿瘤 中巨噬细胞浸润度达50％，并且随着肿瘤恶性程度增加其浸润程度逐渐增 强。因此，基于巨噬细胞开展的嵌合抗体构建，进而形成的CAR巨噬细 胞(CAR-Macrophage，CAR-M)肿瘤细胞治疗技术在今后攻克实体肿瘤 的治疗发展中被寄予厚望。

T细胞的活化需要表面TCR-CD3复合物与MHC分子复合物结合提供 T细胞的活化第一信号，然而肿瘤微环境中MHC分子的表达水平低下， 不能有效提刺激T细胞的第一活化信号，从而导致T细胞的免疫反应和杀 伤作用被抑制。因此研究人员创造性地设计了CAR-T细胞技术，使用含胞 外特异识别肿瘤抗原的scFv段换掉TCR的胞外区域，使其不依赖于MHC分子的作用。Arthur Weiss等发现嵌合抗原受体含有的T细胞内信号域 CD3ζ可激活T细胞信号传导。故CAR-T选择了CD3ζ作为传输胞内激活 信号的基序。

CAR-M肿瘤细胞疗法作为新型肿瘤免疫治疗技术着眼于机体另一重 要免疫细胞-巨噬细胞，开拓了新的细胞治疗领域，然而，当前CAR-M构 建大多在沿用CAR-T细胞的设计单元。例如，来自宾夕法尼亚大学的Saar Gill博士和Michael Klichinsky博士在NatureBiotechnology报道的CAR- 巨噬细胞疗法，采用的是经典CAR-T中特异性发挥T细胞信号转导功能 的CD3ζ信号转导结构域。CAR-M若得以作为独树一帜的细胞免疫治疗机 制，首先如何构建设计真正适用于巨噬细胞信号转导功能的特异性元件亟 待深入探讨。

巨噬细胞的活化须经历两个阶段：致敏阶段和激活阶段。激活是由众 多基因的协同表达驱动完成，期间需要多种跨膜蛋白的参与。巨噬细胞表 面存在多种蛋白分子，均参与介导巨噬细胞活化的过程，包括α1β1整合素、 FcR、CSF-1R、MR、CD36、CD163和CD206等。α1β1整合素通常表达 于巨噬细胞，并通过α1亚基胞外区的I-结构域与细胞外基质(ECM)中的胶原分子相互作用，介导其细胞因子的分泌。α1β1整合素在巨噬细胞的 炎症反应中发挥重要作用，其在介导巨噬细胞活化方面起着重要作用。在 免疫系统中，α1β1只有在被抗原、超抗原或细胞因子激活后才在巨噬细胞 上表达。研究表明，巨噬细胞α1/β1整合素的表达被IFN-γ特异性诱导， 从而促进巨噬细胞的活化和刺激细胞因子的表达。巨噬细胞是肿瘤免疫浸 润的重要组成部分。肿瘤细胞可以分泌白细胞介素和趋化因子等信号分子 来招募巨噬细胞，这使得巨噬细胞天然趋向并浸润至实体肿瘤内。遗憾的 是，巨噬细胞募集到肿瘤组织后，肿瘤细胞为避免被巨噬细胞免疫攻击， 其肿瘤微环境大多低表达IFN-γ等免疫诱导因子，从而无法形成对巨噬细 胞M1型极化及抗癌活化特性的有效激活，客观上促进了实体肿瘤的恶性 进展。