[发明专利]一种提高革兰氏阴性菌外膜通透性的抗菌肽

说明书

本发明公开了一种提高革兰氏阴性菌外膜通透性的抗菌肽。它是以植物乳杆菌素A为模板，通过删减其氨基酸序列、改变氨基酸组成、改变空间结构、改变电荷和疏水性等方法得到新型抗菌肽，该抗菌肽具有较强的抑菌活性，对大肠杆菌的MIC为3.125μg/mL，并且在0.78μg/mL时可显著的提高大肠杆菌外膜的通透性，提高疏水性抗生素对阴性菌的抗菌效果。本发明通过改造植物乳杆菌素A，尤其得到一种有效提高革兰氏阴性菌外膜通透性的抗菌肽OP4，可将红霉素的抗菌效果提高62.5倍。本发明为治疗革兰氏阴性菌的感染提供了新的潜在途径。

技术领域

本发明属于生物技术及分子生物学领域，具体涉及抗菌肽的设计及抑菌机制。

背景技术

革兰氏阴性菌和大肠杆菌和沙门氏菌是引起食物中毒和食源性疾病爆发的关键因素。也是胃肠道疾病和细菌感染的重要致病原。革兰氏阴性菌具有脂多糖和磷脂组成的外膜，该外膜结构致密。因为该膜的不对称性导致多种疏水性抗生素不能进入细胞，发挥杀菌作用。因此革兰氏阴性菌的外膜赋予了其固有的抗生素抗性。因为抗生素的长期、广泛使用，革兰氏阴性菌获得了多种抗生素的抗性基因，因此能有效治疗阴性菌感染的抗生素越来越少。此外，针对于革兰氏阴性菌的抗生素研发也陷入瓶颈，2017年葛兰素史克筛选了超过50万种化合物，没有发现针对阴性菌的有效药物。

发明内容

本发明的目的在于为了克服革兰氏阴性菌对疏水性抗生素的固有耐受性，扩大阴性菌感染的有效治疗谱。本发明提高研究了植物乳杆菌A的抑菌机制，设计了一系列的类似物，并尤其发现了一种能够显著提高革兰氏阴性菌外膜通透性的抗菌肽OP4。通过控制体外实验和小鼠体内实验证实了抗菌肽可显著的提高红霉素对大肠杆菌的抑菌效价。

本发明通过以下技术方案实现：

一种植物乳杆菌素A，其氨基酸序列为QFKNISLMYGNNVSRKTLTNFFKSLIKKIN(SEQ IDNO.1)。

一以上所述的植物乳杆菌素A的类似物，包括以下任一抗菌肽的氨基酸序列：

以上所述的植物乳杆菌素A或其类似物中的任意一种在治疗阴性菌感染的药物中的应用。

本发明建立了大肠杆菌外膜通透性的检测方法，结果表明突变体OP4具有最高的活性。

进一步，构建含有外膜成分的人工脂质体，确认OP4通过疏水性相互作用和静电相互作用与脂多糖LPS结合。干扰LPS的交联进而提高外膜的通透性。

更进一步的，OP4对外膜通透性的提高，可有效增强疏水性抗生素进入细胞的速度，提高该类抗生素对阴性菌的抗菌效果。例如OP4将红霉素对大肠杆菌的抗菌效果提高了62.5倍。

在此基础上，我们使用大肠杆菌感染小鼠腹腔，制作脓毒症模型。在该模型的治疗中OP4显著的提高了红霉素的效价，有效的降低了炎症反应。

附图说明

图1为OP4与外膜结合情况图，指示菌株是大肠杆菌ATCC 35218；

图2为大肠杆菌外膜渗透性图；

图3为PlnA类似物引起的大肠杆菌细胞死亡图；

图4LPS和PlnA类似物的结合图；

图5为敲除lpxA、waaC和waaY相关图；

图6为基因敲除和补充实验证实了OP4和LPS的结合位点图；

图7为OP4促进大肠杆菌对抗生素的吸收情况图；

图8为OP4提高红霉素对大肠杆菌的抑制活性，减轻小鼠炎症相关图；

具体实施方式：

实施例1