[发明专利]一种菠萝酶提取物的纯化方法

说明书

本申请公开了一种菠萝酶提取物的纯化方法，菠萝酶粗提物通过甲基硫代磺酸甲酯可逆改性，再经过SP‑琼脂糖凝胶柱，得到结合的菠萝酶碱性群和流出的非结合的菠萝酶酸性群，这两个亚群分别通过SP‑琼脂糖凝胶柱和Q‑琼脂糖凝胶柱进一步分离纯化，得到至少8种不同形式的菠萝酶。所述菠萝酶组分活性高，组分量大，提取率高；采用本申请分离纯化的菠萝酶组分进行的酶学实验结果可信度高。

技术领域

本申请涉及酶分离纯化领域，特别涉及一种菠萝酶纯化提取方法。

背景技术

菠萝蛋白酶粗提物是一个重要的蛋白酶混合物，属于木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶。不同形式的菠萝酶具有相同的酶学活性和非常相似的物理化学性质，运用经典的色谱方法将它们分离开是一个非常大的挑战。而且，半胱氨酸巯基能够被氧化，-SH转化为-SO_XH。分离的菠萝蛋白酶中有30％-50％被氧化而失去活性，而且这种氧化是不可逆的。这些失去活性的成分很难被从虽然被氧化但是可逆的成分和具有活性的成分中分离开，进而导致生物化学鉴定错误，尤其会导致酶学性质和特殊活性鉴定结果的错误。

针对菠萝蛋白酶提取，已有文章报道，如朱明英等，菠萝蛋白酶的提取和分离，云南热作科技，1998,21(1)：22-23，但是没有对菠萝酶的具体组分进行细分。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种菠萝酶提取物分离纯化方法，能够大幅度降低菠萝酶提取过程中失去活性的菠萝酶的量，能够分离得到高活性的同质的菠萝酶组分，得到的菠萝酶组分的量能够进行下一步的酶学实验。

本发明提供了一种方法，能够从菠萝蛋白酶混合物中纯化至少8种不同形式的酶。经过SP-琼脂糖凝胶柱，得到两个具有蛋白水解活性的亚群：结合的菠萝酶群是碱性群，非结合的菠萝酶群是酸性群。通过甲基硫代磺酸甲酯可逆改性，这两个亚群分别通过SP-琼脂糖凝胶柱和Q-琼脂糖凝胶柱和进一步分离，这个过程获得了高度纯化的不同分子量组分，这些组分具有不同的生物化学性质。

本申请通过把一个可逆的5kDa的甲基硫代磺酸甲酯共价嫁接在菠萝蛋白酶上，使得菠萝蛋白酶具有自由的巯基功能。这种处理能够保护蛋白酶不被氧化或自我分解。在离子交换层析时，巯基-甲基硫代磺酸甲酯处理的成分比没有用甲基硫代磺酸甲酯处理的成分洗脱快。这可能是因为电荷屏蔽引起的。这种效果使得它们能够被分离和纯化。制备高活性的同质的蛋白酶是进行酶学研究的基础。而且对酶的晶体结构进行研究只能依赖高度纯化的样品。

本申请的技术方案是这样实现的：

一种菠萝酶提取物的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将菠萝酶粗提物、EDTA和二硫苏糖醇加入醋酸钠缓冲液中进行均质处理，得到菠萝酶粗提物处理液；

(2)将甲基硫代磺酸甲酯加入到所述菠萝酶粗提物处理液中混合反应得到菠萝酶悬浮液，再将所述悬浮液离心去沉淀得到菠萝酶上清液；

(3)将所述菠萝酶上清液过SP-琼脂糖凝胶柱：用醋酸钠缓冲液进行预处理和洗脱，得到结合的菠萝酶碱性群和流出的非结合的菠萝酶酸性群；

(4)所述非结合的菠萝酶酸性群过Q-琼脂糖凝胶柱，得到酸性菠萝酶组分；

(5)洗脱步骤(3)所述SP-琼脂糖凝胶柱上结合的菠萝酶碱性群，得到碱性菠萝酶组分。

进一步的技术方案是，所述步骤(1)中菠萝酶粗提物处理液中所述菠萝酶粗提物的质量浓度为0.15-0.30g/L，EDTA的浓度为0.5-1.5mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2-3mmol/L，醋酸钠缓冲液的浓度为0.8-1.2mol/L，并用氢氧化钠调节醋酸钠缓冲液pH为4.0-6.0。

进一步的技术方案是，所述步骤(2)中菠萝酶粗提物处理液中甲基硫代磺酸甲酯的浓度为15-25mmol/L，甲基硫代磺酸甲酯与菠萝酶粗提物处理液混合反应的时间为20-40min。