[发明专利]用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子及其应用

说明书

本发明公开了用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子，所述启动子用于启动Cas9核酸酶的表达，称为pNUC1。本发明还公开了包含pNUC1的表达盒组以及包含所述表达盒组的重组载体。实验证明，采用数据驱动策略选定的pNUC1驱动Cas9核酸酶的表达，可以极高效地定点编辑拟南芥基因组。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子、表达盒及其用途。

背景技术

成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是大多数细菌和古细菌中RNA介导的适应性免疫系统，由CRISPR基因座和Cas蛋白组成，通过切割噬菌体等入侵者的核酸基因组来消灭噬菌体或其他外来质体。CRISPR基因座被转录成非编码RNA，可以与Cas蛋白形成复合物以介导互补入侵DNA的切割。利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑基因组，已成功应用于拟南芥、水稻、玉米、烟草以及番茄等多种植物。

在拟南芥的CRISPR/Cas9系统中，大多使用花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子驱动Cas9的表达，但多项研究表明，CRISPR/Cas9系统在拟南芥中的编辑效率远低于水稻，且发生基因编辑的T1代大部分为体细胞突变。这主要是由于CaMV 35S启动子在植物的胚胎形成过程中表达量不高，而在营养组织中强烈表达，但只有生殖细胞中发生的突变才能传递给下一代。因此，选用合适的启动子驱动Cas9的表达以提高拟南芥中基因编辑的效率非常重要。近年来，为了提高CRISPR/Cas9系统在拟南芥中产生可遗传突变的效率，生殖细胞特异性或细胞分裂特异性基因启动子，如pEC1.2en-EC1.1融合和pYAO等(WANG Z P,XING H L,DONG L,et al.Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficientlygenerates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in asingle generation[J].Genome biology,2015,16:144；YAN L,WEI S,WU Y,et al.High-Efficiency Genome Editing in Arabidopsis Using YAO Promoter-Driven CRISPR/Cas9 System[J].Molecular plant,2015,8(12):1820-3)，已被用作替代启动子驱动Cas9的表达。使用以上Cas9系统，尽管在在T1代产生了可遗传的非嵌合突变，但效率仍然较低，不超过10％，由此可见，找到更高效驱动Cas9基因表达的启动子对于进一步提高靶点编辑效率尤为重要。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供以下技术方案。

一方面，本发明提供用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子，其特征在于，所述启动子用于启动Cas9核酸酶的表达，所述启动子称为pNUC1，其是：

a.所述启动子pNUC1的序列如SEQ ID NO:1自5'末端第1448-2919位所示；

b.与a限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子NUC1p功能的核苷酸分子；或

c.与a或b限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子pNUC1功能的核苷酸分子。

在一些实施方案中，所述启动子与SEQ ID NO:1自5'末端第1448-2919位所示序列具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。