[发明专利]功能增强型内皮细胞的驯化方法及驯化得到的细胞制剂

说明书

本发明属于生物技术和生物医药技术领域，涉及使用内皮细胞治疗缺血性糖尿病足的方法以及所用的细胞制剂。针对现有ECs移植治疗缺血性DF时细胞不耐受DF高糖、低营养的局部微环境，细胞容易凋亡等问题，本发明提供了一种体外驯化诱导功能增强型内皮细胞的方法和用于治疗缺血性糖尿病足的FE‑ECs制剂，通过人工模拟糖尿病足高糖低营养微环境，同时添加经筛选得到的TGF‑β抑制剂，驯化诱导得到FE‑ECs。与未诱导的内皮细胞相比，FE‑ECs更能耐受高糖、低营养培养环境，保持旺盛的增殖活力和内皮细胞功能。本发明方法操作简便，诱导的细胞易于体外扩增和长期保存，实现了细胞规模化扩增培养，具有很好的研究价值，同时在创伤修复领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药技术领域，涉及使用内皮细胞治疗缺血性糖尿病足的方法以及所用的细胞制剂；更具体的，涉及一种功能增强型内皮细胞的驯化方法及驯化得到的细胞制剂。

背景技术

随着现代生活方式的改变和人口老龄化程度的加剧，糖尿病的发病率越来越高。长期高血糖可引起各种急、慢性并发症的发生。其中，糖尿病足(Diabetic foot，DF)是糖尿病最常见的并发症之一，多由血管病变、神经病变和/或感染等综合因素引发，形成局部顽固性皮肤溃烂和/或深部肌肉组织和骨质的破坏，具有极高的致残和致死率。与一般慢性创面修复相比，DF的治疗过程更为复杂，并且治疗周期长，感染难控制，是糖尿病患者反复住院的主要原因。伴随着糖尿病在全世界范围内的高发，DF也将成为我国慢性疾病治疗的主要社会经济负担。

糖尿病血管病变引起的下肢血供障碍是DF发生、发展的主要原因，治疗血管病变，改善微循环是DF治疗的关键。由于糖尿病所致下肢血管狭窄、闭塞是一个极其复杂的病理过程，血管腔内介入治疗、外科血管旁路移植以及超声消融等疗效欠佳，尤其是下肢动脉流出道闭塞而且缺乏代偿性侧支循环的患者，目前尚无有效的治疗方法。因此，深入研究促进DF局部血管新生和血运重建的有效方法具有重要的理论和现实意义。

近年来，细胞治疗发展迅速，通过补充具有增殖活性的内皮细胞(ECs)，促进旁路血管新生，改善患肢血循环，为DF的治疗带来了新的希望。ECs在血管损伤修复中发挥关键作用。组织缺血损伤后，低氧诱导因子α(HIF-1α)表达上调，激活基质衍生因子及其下游信号分子，如趋化因子CXCR4，动员内皮祖细胞EPCs离开骨髓进入外周血中并沿基质细胞衍生因子(SDF-1)的浓度梯度迁移至损伤部位并分化为ECs。多种促血管内皮生长因子可以进一步促进SDF-1的表达，加强EPCs动员。但是研究表明糖尿病患者EPCs的HIF-1α/VEGF/SDF-1α分子通路存在障碍，EPCs动员受限。长期高血糖可导致晚期糖基化终产物(AGEs)产生增多，AGEs能显著抑制ECs的增殖、迁移，促进其骨化和凋亡，导致外周血中ECs数量较非糖尿病患者明显减少。而且AGEs可通过改变胞内蛋白功能，诱导炎症，激发ROS等途径诱导ECs功能异常和凋亡，降低ECs对缺血/缺氧刺激的反应性，细胞活力和成管能力降低。同时，增加的AGEs可通过抑制HIF-1α转录活性，下调调节细胞和内皮细胞自身的促血管生长因子的分泌，抑制血管新生。以上因素导致的高糖低生长因子的微环境，极大降低了ECs移植治疗DF的长期疗效。

目前已有多种方法用于提高ECs体内存活并维持血管再生功能。通过构建高表达人CXCR7的工程化ECs，利用CXCR7介导SDF-1，增强ECs向缺血局部的迁移，从而增加ECs移植治疗缺血性疾病的疗效。该方法中，基因修饰得到的工程化ECs，会增加细胞安全性风险。另外，有研究将携带促血管生成蛋白因子VEGF的纳米颗粒联合ECs植入体内，增强ECs在体内的滞留和增殖能力。该方法中的外源纳米颗粒联合应用可能会增加移植细胞毒性，且该方法多只针对有限的靶点，作用时间短，不能维持细胞治疗的长期疗效。

因此，开发一种能在高糖、低生长因子条件下保持较强增殖能力和成血管能力的ECs及培养方法，用以提高ECs移植治疗缺血性DF的长期疗效，具有十分重要的科学价值与临床意义。

发明内容