[发明专利]一种比率型过氧亚硝酰荧光探针、制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种比率型过氧亚硝酰荧光探针，具体地，本发明的探针可作为过氧亚硝酰荧光探针用于过氧亚硝酰的检测、测量或筛选。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：可以高特异性地识别过氧亚硝酰；可以快速响应过氧亚硝酰；可以高灵敏地分析过氧亚硝酰的浓度；可以实现对过氧亚硝酰的比率定量分析；生物毒性低，可以应用生物细胞中的过氧亚硝酰成像，并可以实现对细胞内过氧亚硝酰变化的荧光信号响应及其实时可视化检测；合成简单，性质稳定，可以长期保存使用。

技术领域

本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种比率型过氧亚硝酰荧光探针及其 在测量、检测或筛选过氧亚硝酰及活细胞荧光成像方法中的应用；本发明还提 供了制备所述荧光探针的方法。

背景技术

过氧亚硝酰(ONOO^-)是一种重要的活性氧物种，它通过一氧化氮和超氧 化物之间的反应内源性地产生。过氧亚硝酰在信号转导中起着至关重要的作用， 并且由于其异常强效的氧化能力和亲核特性，可以破坏许多关键的生物分子， 如蛋白质，脂质和核酸。过氧亚硝酰水平的异常与一些疾病相关，例如心血管 疾病，神经退行性疾病，炎症疾病，癌症等。因此，开发用于监测过氧亚硝酰 的分析方法对于相关疾病的诊断有十分重要的作用。

近年来，荧光探针广泛用于检测生命系统中的生物活性分子，虽然目前已 开发出许多用于检测生物系统中过氧亚硝酰的荧光探针，但是大多数荧光探针 都是单发射波长。与单波长探针相比，比率型荧光探针具有消除多种干扰因素 的优点，例如探针定位，环境变化，激发和发射效率等。据我们所知，只有少 数荧光探针可以比率监测线粒体中的过氧亚硝酰，而且用单一激发波长实现比 率检测的探针更少。Qian课题组开发了一种基于FRET机理的比率探针，可用 于线粒体中过氧亚硝酰的半定量化检测；Yuan课题组报道了一种荧光探针，在 发炎的小鼠模型中对内源性过氧亚硝酰进行比率荧光成像；Li课题组报告了两例比率探针用于监测线粒体内的过氧亚硝酰。综上所述，开发一种单一激发波 长的用于高选择性的、高灵敏度的检测过氧亚硝酰比率型荧光探针具有重要意 义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是在于提供一种比率型过氧亚硝酰荧光探针以及 它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高、能够检测过氧 亚硝酰，并且能够在生理水平条件下对过氧亚硝酰进行有效测量、检测或筛选。

具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：

其中：R₁，R₂为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧 基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R₁，R₂，可以相同或不同。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是R₁，R₂，均为氢原子 的式(Ⅱ)化合物，其结构式如下：

本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的制备方法，包括如下步骤：

使式(Ⅲ)化合物与式(Ⅳ)化合物反应制备得式(Ⅰ)化合物：

其中：R₁，R₂为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧 基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R₁，R₂，可以相同或不同。

具体而言：将式(Ⅲ)化合物和式(Ⅳ)化合物与碳酸钾在N,N-二甲基甲 酰胺中加热回流反应，反应结束后，通过减压旋蒸得到固体，然后，进一步通 过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式(Ⅰ) 化合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述式(Ⅳ)化合物和式(Ⅲ)化合物 的摩尔比为1:1-1:5。