[发明专利]一种纤维素内切印迹模拟酶、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种纤维素内切印迹模拟酶的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）模板分子优选：

采用底物类似物麦芽糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖以及过渡态类似物麦芽糖环己烯衍生物、纤维二糖环己烯衍生物、纤维三糖环己烯衍生物和纤维四糖环己烯衍生物中的一种作为模板分子；

（2）生物源交联功能单体的制备：

将10 mmol的氨基酸置于300 mL的四口瓶中，加入100 mL的水和10 mmol-30 mmol的三乙胺，待完全溶解后，在冰水浴下搅拌20 min，缓慢滴加丙烯酰氯10 mmol-50 mmol，滴完后在冰水浴下反应1 h-3 h，放入微波反应仪器反应0.5 h-4 h，所得产物溶液调节pH值为1-6，用乙酸乙酯液液萃取3次，合并有机相，低温冷冻干燥，常温密封保存；

（3）氨基化聚苯乙烯微球：

将聚乙烯吡咯烷酮、烷基酚聚氧乙烯醚或聚乙二醇水溶液作为分散剂，加入苯乙烯单体，通入氮气保护，加热至60 ℃-80 ℃，搅拌，加入引发剂偶氮二异丁腈，恒温反应12 h-72h，得到聚苯乙烯微球；

将3-氨丙基三乙氧基硅烷加入硝基苯和二氯甲烷的混合溶剂中，涡旋震荡混匀，加入所述聚苯乙烯微球，通入氮气保护，加热至60 ℃-90 ℃，恒温反应5 h-9 h，即得到氨基化聚苯乙烯微球；

（4）分子印迹凝胶微球的制备：

氨基化聚苯乙烯微球硼酸化：将氨基化苯硼酸类单体溶解于pH 7.2 0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液中，室温下，磁力搅拌溶解，制得氨基化苯硼酸类单体溶液；将步骤（3）所得氨基化聚苯乙烯微球悬浮于50 mL-500 mL pH 7.2 0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液，涡旋混匀，制得氨基化聚苯乙烯微球悬浮液；将氨基化苯硼酸类单体溶液和戊二醛水溶液分别同时缓慢逐滴加入氨基化聚苯乙烯微球悬浮液中，室温下搅拌反应，产物放入透析袋中，经去离子水透析5天，每天更换3次透析液，监测透析袋外液至透析完全，将产物混悬液静置，去除微球自偶联物沉淀，收集上层液体，离心，用去离子水离心洗脱7次，乙醇离心洗脱3次，真空冷冻干燥至恒重，对产物进行分析表征，制得硼酸化氨基聚苯乙烯微球；

聚苯乙烯凝胶微球的制备：将所述硼酸化氨基聚苯乙烯微球悬浮于50 mL-500 mL去离子水中，加入步骤（1）所述的模板分子，待模板分子与硼酸化氨基聚苯乙烯微球的硼酸基团形成可逆共价键后，再加入步骤（2）所得生物源交联功能单体、离子液体功能单体、金属离子、引发剂、增敏剂和交联剂，加热至40 ℃-60 ℃，恒温磁力搅拌，氮气氛下引发聚合12 h-24 h，产物经乙酸水溶液和乙醇依次离心洗脱后，除去未反应的组分和模板分子，直至洗脱液中无模板分子出现为止。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤（2）中，所述氨基酸为组氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸中的一种，构型为L型或D型。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，所述分散剂的添加量为0.5%-12%，苯乙烯单体的添加量为13%-44%，引发剂偶氮二异丁腈的添加量为苯乙烯单体量20%- 50%；硝基苯和二氯甲烷混合溶剂中二者的体积比为1:3-10，每克聚苯乙烯微球所对应的3-氨丙基三乙氧基硅烷的添加量为1 mL/g-3mL/g。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤（4）中，所述氨基苯硼酸类单体的种类为3-氨基苯硼酸、4-氨基苯硼酸、2-氨基苯硼酸、2，3-二氨基苯硼酸、2，4-二氨基苯硼酸、3，4-二氨基苯硼酸和2，3，4-三氨基苯硼酸；所述的戊二醛水溶液的浓度为20%-35%；氨基苯硼酸类单体的添加量为3-氨丙基三乙氧基硅烷的等摩尔量；戊二醛的添加量为总溶液体积的10%-25%。