[发明专利]一种肠道菌群的过滤提取方法

说明书

本发明提供一种肠道菌群的过滤提取方法，本发明通过对菌群重量、活性、单位菌量和菌群结构为指标对肠道菌群提取过程中的不同洗脱层级数进行评估，得到最优的洗脱层级为5层过滤网(50目、80目、100目、120目、150目)。菌液分别经4层、5层和6层过滤得到的菌泥，使用生理盐水进行洗脱后离心获得菌泥，结合高通量测序从菌落结构和菌群相对丰度进行评估验证，发现经过5层滤网洗脱与经过4层过滤和6层过滤洗脱后菌落结构不同，并且5层滤网洗脱后菌群丰度种类多于经过4层和6层过滤网洗脱。实现了确保减少除优质肠道菌群以外的成分并确保获得优质肠道菌群得率和活性。

技术领域

本发明涉及菌群提取技术领域，尤其涉及一种肠道菌群的过滤提取方法。

背景技术

菌群移植是一种将从健康供体提取出的菌群移植到患者的肠道从而实现疾病治疗的微生态干预方法，其能够有效治疗艰难梭菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征等各种传统治疗手段难以根治的疾病，同时在肿瘤、糖尿病、自闭症等一些难以治愈的重大疾病上也有较好的辅助治疗能力。诸多环节中，菌群的高效提取是保证移植有效及安全的重要因素之一。健康人群的粪便中大部分是水分，其余主要由各种微生物、纤维成分和可溶性物质组成。因此，如何有效的分离出肠道菌群，保持肠道菌群的数量、活性及菌群丰度，成为亟待解决的问题。

目前常用的肠道菌群分离提取技术主要有过滤法、离心法以及先过滤后离心的联合使用方法。研究表明，过滤网层数、口径等参数对收集的菌群质量和数量有较大影响，如过滤条件直接影响菌群的得率、活菌数量以及菌群多样性等；过滤对收集菌群至关重要，而现有技术中，一部分研究主要集中在菌群的品质纯度上，牺牲了菌群得率；而另一部分研究重心则放在菌群的得率上，牺牲了菌群的活性，收集到的菌泥中含有大量菌泥以外的杂质成分，在过滤的工艺上无法兼顾品质与得率。因此，本研究进行了不同洗脱层级过滤对菌群影响的探讨工作，以期解决上述问题。

发明内容

本发明旨在解决上述问题。本发明的一个目的是提供一种肠道菌群的过滤提取方法，该方法能减少肠道菌群以外的杂质成分并确保肠道菌群的高得率和高活性。

为达到此目标，本发明采用以下技术方案：

一种肠道菌群的过滤提取方法，包括以下步骤：

步骤S00初步处理：收集健康供体新鲜粪便a份，按稀释比例溶解于b份的生理盐水中，得到混合液D；

步骤S10洗脱处理：将步骤S00中的混合液D通过5层滤网过滤，其中滤网目数依次为50目、80目、100目、120目、150目，在每次过滤时用刮板手动协助过滤，收集得到d份菌群悬液E；

步骤S20离心处理：将步骤S10中得到的菌群悬液E离心处理得到菌泥F；

步骤S30产品获取：将步骤S20中得到的菌泥F加入相应的冻存保护剂后放入冰箱中进行冷冻保存。

本发明优选的技术方案在于，还包括步骤S11取样检测：将步骤S10中得到的菌群悬液E取样2份至不同的无菌离心管中离心处理，分别进行活菌数及菌群重量测定。

本发明优选的技术方案在于，在步骤S11中，在对活菌数测定时，先将离心得到的菌泥稀释若干倍，用LIVE/DEADBacLight Bacterial Viability Kit对稀释后的菌泥进行染色，采用BD Accuri C6流式细胞仪分析菌泥的活菌率和总菌数。

本发明优选的技术方案在于，在步骤S11中，在对菌群重量测定时，通过分析天平称取离心后收集菌群的重量，并进行得率的计算。

本发明优选的技术方案在于，步骤S11中对活菌数测定以及菌群重量测定的试验数据均采用SPSS 22.0Univariate方法单因素分析，对F检验达到显著水平的因子进行方差分析并进行Duncan氏组间多重比较，各组试验数据均以(平均值±标准差)表示。