[发明专利]草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用

权利要求书

1.草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，所述草果AtDRM1基因的DNA序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)扩增草果AtDRM1基因；

2)用BglⅡ和BstEⅡ限制性内切酶对质粒pCAMBIA1301双酶切，使质粒pCAMBIA1301线性化，将线性化质粒pCAMBIA1301与草果AtDRM1基因进行同源重组反应，产物转化至DH5α感受态中，并在涂布有抗生素的培养基上培养，对培养基上的单菌落进行阳性验证，获得pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒；

3)pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒转化至农杆菌，并利用农杆菌侵染植物，筛选及鉴定转基因植株，即得耐热性提高的植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，草果AtDRM1基因的扩增方法包括以下步骤：

a)取草果叶片0.2-1g，放入含研磨珠的离心管中，液氮速冻，研磨成粉，获得粉体；

b)提取粉体中的植物总RNA，并将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化，获得草果AtDRM1基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以cDNA为模板进行PCR扩增时的上游引物为SEQ ID NO.2:actcttgaccatggtagatctgatggttctccttgataagatgtgg；下游引物为SEQ IDNO.3:ggggaaattcgagctggtcacctcaacggtgggtgctcttcg。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以cDNA为模板进行PCR扩增时反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；反应体系为：高保真酶25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA 2μL，ddH₂O 19μL。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用农杆菌侵染植物的方法为将植物种子消毒，并用无菌水清洗干净，置于培养基上培养，种子发芽并长出2-4片叶后，将幼苗转移至泥炭土中培养，待植物开花时，利用含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌对花序浸染，即实现农杆菌对植物的浸染。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌对花序浸染的方法为吸取2-5mL含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌接种于100-200mL含50-100mg/L卡那霉素和50-100mg/L利福平的YEP液体培养基中，25-30℃，200-250rpm下培养至OD值为1.0-1.2；将菌液转移至无菌离心管中，5000-6000rpm下离心10-15min，弃上清，用转化液重悬菌体至OD600为0.8-1.0，获得含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌浸染液，将植株的花序浸泡在农杆菌浸染液中30-60s，避光培养24-36h，重复转化1-2次。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，筛选及鉴定转基因植株的方法为利用农杆菌侵染植物后收获植物的种子T0，将种子T0消毒并用无菌水清洗干净，置于抗性培养基上培养，选择正常生长的植株进行培养，收获种子T1；对种子T1进行分离比例筛查，选择符合3:1分离比例的植株培养，收获T2代种子；用抗性平板筛选种子T2，选择出苗并成活的植株继续培养，收获T3代种子，提取T3代植株叶片的DNA，进行PCR验证；提取T3代植株叶片的总RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR检测表达量，即获得阳性且基因表达量高的植株。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR的上游引物为SEQ ID NO.4:ggtctctccaaagccttt；下游引物为SEQ ID NO.5:agatattgaacggtggaacat。