[发明专利]一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用

说明书

本发明提供了一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用，属于生物医学技术领域；所述重组胰腺癌细胞包含重组载体；所述重组载体上插入有目的基因pHluorin_M153R‑CD63。本发明利用插入有目的基因pHluorin_M153R‑CD63的重组载体进行胰腺癌稳定细胞系的构建，并对细胞外的外泌体及其释放于细胞外基质中的尾部斑点进行有效标记后，可更容易地观察其寻径轨迹，从而揭示迁移活细胞的致病行为。本发明解决了外泌体致病行为机制研究中的可视化难题，构建得到了明亮、稳定、且适用于多种细胞培养环境的荧光示踪物质，可监测活细胞在迁移过程中外泌体的释放和摄取量，以及寻径轨迹的观察。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用。

背景技术

外泌体是一类大小为30～150nm、呈茶托状的由脂质双层膜包裹的细胞外囊泡，广泛存在于细胞培养上清及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、卵泡液、精液、心包液、乳汁等。外泌体起源于细胞内体，细胞质膜的连续内陷最终导致多囊泡体的形成，多囊泡体与细胞内的其他囊泡和细胞器相互作用，导致外泌体的最终形成，并促进外泌体成分的多样性。细胞成分通过外泌体进行细胞间的交流与运输，肿瘤细胞分泌的外泌体可以通过塑造肿瘤微环境来帮助其转移，其分泌数量可直接影响到肿瘤的转移，也在促进肿瘤形成和增殖的过程中发挥十分重要的作用。据报道，外泌体存在于所有生物体液中，通过生物体液取样可以很容易地获得外泌体复合物的组成，基于生物液体活检可显示出外泌体在诊断肿瘤和其他疾病以及揭示其预后的方面有着重大潜力能。而外泌体具体致病行为机制的研究难以突破，多受限于其行为过程的可视化呈现。

胰腺癌是消化道常见恶性肿瘤之一，在肿瘤领域素有“癌症之王”的称号。胰腺癌具有外泌体明显分泌增强的特点，研究胰腺癌疾病深层机制的一大难题就是对外泌体行为的观察、测量及可视化。

体内追踪外泌体可以提供有关外泌体的生物分布、迁移能力、毒性、生物学的重要知识角色，沟通能力和行动机制。现有技术中，研究人员使用分子生物学方法将荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白GFP；红色荧光蛋白RFP)与外泌体膜上的标记蛋白如CD63、CD9、CD81等融合表达可以跟踪外泌体从供体到受体细胞的运动。通过监测膜蛋白的荧光，可以实现活体培养物中和体内外泌体转移的直接可视化。例如，将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中，随后用此慢病毒感染细胞，使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。但是，常规的GFP-CD63的外泌体示踪方法中，荧光不稳定且不够明亮，难以对动态的外泌体释放及摄取实行可视化。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用，基于本发明重组胰腺癌细胞进行的外泌体示踪方法，荧光稳定且明亮，能够对动态的外泌体释放及摄取实行可视化。

本发明提供了一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞，所述重组胰腺癌细胞包含重组载体；所述重组载体上插入有目的基因pHluorin_M153R-CD63；所述目的基因pHluorin_M153R-CD63为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因。

优选的，所述重组载体的原始载体包括pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO。

优选的，所述pHluorin_M153R-CD63在pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO上的插入位点的5’端的限制性酶切位点为EcoR I，3’端的限制性酶切位点为NotI。

本发明还提供了上述方案所述的重组胰腺癌细胞在制备用于胰腺癌细胞外泌体示踪的试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种胰腺癌细胞外泌体示踪的方法，包括以下步骤：

使用荧光显微镜对上述方案所述的重组胰腺癌细胞进行镜下观察。

优选的，所述镜下观察包括活细胞观察和/或细胞免疫荧光观察。