[发明专利]一种土壤菌筛选分离方法

说明书

本发明涉及土壤菌技术领域，且公开了一种土壤菌筛选分离方法，包括以下步骤：S1：土壤采样，采集杜仲林下的腐殖质土，然后备用；S2：富集培养，将取自杜仲林下的土壤分别加入PDA和NA培养基中富集真菌和细菌，37℃细菌和55℃嗜热菌每3d一次，共富集3次，真菌则每10d一次，共富集3次。本发明通过平板涂布法将菌进行分离，然后挑取生长速度快、菌落数量占优势的菌种接种能够快速对菌落进行分离，方便后面的筛选确认，通过把菌液稀释涂布于果胶琼脂培养基和纤维素琼脂培养基上，按照菌落的生长情况进行结果记录，能够清楚的了解不同的菌落在培养基上的生长情况，从而快速进行筛选适合的菌株。

技术领域

本发明涉及土壤菌技术领域，具体为一种土壤菌筛选分离方法。

背景技术

杜仲胶是杜仲中存在的一类高分子化合物，杜仲的树皮、叶及种皮中均含有丰富的杜仲胶，其叶含杜仲胶2％～4％、树皮含6％～10％、种子含10％～18％。杜仲胶作为一种天然高分子材料，是国际上公认的能够替代传统三叶橡胶的胶源，与天然橡胶同为异戊二烯的高聚物，是反式异戊二烯的高聚体，其独特的橡-塑二重性使其成为新材料开发领域中的研究热点，。

传统的化学法提取杜仲胶，由于含胶细胞的细胞壁不易被有机试剂溶解，胶体不易溶出，且溶剂对细胞壁的分解作用是有限的，因此该法在杜仲胶的提取过程中存在杜仲胶产出率低、提取工艺复杂、对环境污染严重且生产成本高等问题。

现有的生物酶如纤维素酶、果胶酶等，经验证不能有效的降解杜仲叶使维管结构暴露从而分离杜仲胶。

经调查研究发现，杜仲林土壤中的落叶经过一定时间，其纤维及维管结构会被降解而杜仲胶丝保留并暴露出来，说明土壤中可能存在可有效降解杜仲叶提取杜仲胶丝的微生物菌种资源，因此提出一种土壤菌筛选分离方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种土壤菌筛选分离方法，解决了不能从土壤中筛选分离出能够有效降解杜仲叶的微生物菌种资源的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种土壤菌筛选分离方法，包括以下步骤：

S1：土壤采样，采集杜仲林下的腐殖质土，然后备用；

S2：富集培养，将取自杜仲林下的土壤分别加入PDA和NA培养基中富集真菌和细菌，37℃细菌和55℃嗜热菌每3d一次，共富集3次，真菌则每10d一次，共富集3次；

S3：再次培养，将单菌落接入液体培养基中，置于30-38℃，150r/min震荡条件下，遮光培养36-48h，得到单菌落培养液，培养基的成分为葡萄糖3-6份，Na2HPO 1-3份，CaCO1-3份，MgSO 4·7H 2O 3-5份，琼脂1-8份，黄豆粉0.5-2份、水200份；

S4：涂布分离，富集结束后取一定的菌液利用平板涂布法将菌进行分离，挑取生长速度快、菌落数量占优势的菌种接种并保存，共分离出7株37℃菌，代号分别为37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6、37-7，55℃菌5株，代号分别为55-1、55-2、55-3、55-4、55-5，25℃菌10株，代号分别为25-1、25-2、25-3、25-4、25-5、25-6、25-7、25-8、25-9、25-10；

S5：菌株初筛，将细菌接种于NA液体培养基，真菌接种于PDA液体培养基中，分别于37℃、25℃、55℃培养，然后将菌液稀释涂布于果胶琼脂培养基和纤维素琼脂培养基上，按照菌落的生长情况进行结果记录；