[发明专利]猪圆环病毒亚单位疫苗

说明书

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及猪圆环病毒亚单位疫苗。本发明通过点突变获得了猪圆环病毒2型Cap蛋白的突变体，进一步利用翻译增强子构建了高效的杆状病毒Cap蛋白的转录单元。实验结果表明，本发明突变体联合使用Syn21和P10UTR可以显著提高PCV2 Cap蛋白的表达量，而且形成的VLPs产量也提高了约4倍。另外，本发明构建的杆状病毒系统不但可以应用于亚单位疫苗和VLPs疫苗的生产，也为动物疾病的杆状病毒基因工程疫苗的的研究和推广奠定了基础。

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及猪圆环病毒亚单位疫苗。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中严重流行，临床上常与猪高致病性繁殖与呼吸综合征、猪口蹄疫以及猪细小病毒病等混合感染、继发感染给全世界养猪业造成了重大的经济损失。PCV2不仅是引起PMWS的病原体，而且还与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤(CT)、坏死性淋巴结炎、肉芽肿性肠炎及渗出性表皮炎等疾病密切相关，这些与PCV2相关的疾病统称为猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)。PCV2感染可以破坏动物机体的免疫系统，造成严重的免疫抑制，容易诱发多种细菌及病毒的混合感染与继发感染给疾病的诊断和治疗带来巨大的困难。

PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是一种共价闭合、单股环状负链DNA病毒呈二十面体对称，无囊膜。PCV2病毒粒子直径为17nm，基因组大小约1.7kb，是目前发现的最小的动物病毒。PCV2的基因组结构存在11个开放阅读框(ORFs),即ORF1～0RF11，ORFs之间大小相差悬殊,所编码的蛋白大小在2～36kDa。ORF1与ORF2是PCV2最大的2个开放阅读框，分别编码与病毒复制相关的蛋白Rep和Rep'以及病毒的结构蛋白Cap。Cap蛋白作为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，是PCV2的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生特异性免疫应答，是研制PCV2基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。ORF3为病毒复制的非必需基因，其编码的蛋白可诱导PCV2感染的细胞发生凋亡。许多学者在PCV2基因组结构与功能方面开展了大量研究，除ORF1、ORF2与ORF3的功能研究较为透彻外，其他ORFs的功能尚不十分清楚。

在我国已报道的PCV2基因亚型有PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e五种。血清学调查发现国内猪群阳性率高达52.8％～100％，发病率高达50％,死亡率因猪场条件、继发感染等情况不同，一般在5％～70％,给养猪业造成巨大经济损失。疫苗免疫对PCV2的预防控制起到关键性作用。

目前，市场上销售的基因工程亚单位疫苗有二种类型：第一类是大肠杆菌表达系统，青岛易邦采用PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达PCV-2Cap蛋白，制备亚单位疫苗，但是原核表达易出现包涵体，包涵体没有活性，需要进行蛋白复性来提高疫苗效果；第二类是昆虫杆状病毒表达载体系统，勃林格、英特威/先灵葆雅为昆虫杆状病毒表达的基因工程亚单位疫苗，由于该系统所需要的周期远比动物或植物系统短，可以利用昆虫个体或其培养细胞进行大规模的表达生产，生产的重组蛋白产量高，蛋白翻译后加工比细菌、酵母生产系统完善，然而其昂贵的疫苗价格限制其广泛的应用，国内在这方面虽做了不少研究工作，但并未实现产业化。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供高表达量的猪圆环病毒亚单位疫苗。

本发明提供了猪圆环病毒2型Cap蛋白的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的突变体为在野生型Cap蛋白的基础上，132位氨基酸由Asp突变为Leu氨基酸。