[发明专利]温控无细胞反应体系的构建方法和该方法使用的质粒以及用途

说明书

本发明涉及一种质粒，其包括：编码温度敏感元件的基因；位于所述编码温度敏感元件的基因下游的能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元；位于所述操纵单元下游的表达目标蛋白的外源基因。本发明的质粒能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元调控目标蛋白的表达，当温度升高到给定温度时，所述温度敏感元件失活从而操纵单元启动表达目标蛋白，当温度低于给定温度时，所述温度敏感元件抑制操纵单元启动表达目标蛋白。本发明通过所述质粒进一步提供了一种温控无细胞合成体系的构建方法，实现了在无细胞体系中通过温度调控其中目标蛋白的表达。

技术领域

本发明属于生物反应体系领域，具体涉及温控无细胞反应体系的构建方法以及该方法使用的质粒以及用途。

背景技术

生物过程控制是生物制造和基因工程领域的一个重要问题。蛋白质合成和特定位点生物功能的时空激活和调控在生物技术、医学和工业生产等领域具有重要意义。目前常用的控制方法是利用分子的化学效应调节基因表达。然而，该方法也存在一些缺点，包括化学效应不稳定\空间精度低以及化学诱导剂可能带来的其他不良副反应。利用光和热等物理信号来控制生物过程是一种理想的方法。相对于光信号对机体渗透性较差，温度作为一种独特的物理信号，可以准确有效地控制整体和局部温度。温度调节表达体系依赖于一种强大而精细调节的启动子，避免使用特殊介质、有毒或昂贵的化学诱导剂。

目前，温度调控表达已成功用于许多重组蛋白和肽的生产。温度是一个非常明确的信号，可以通过外部触发的方式如聚焦超声、红外光和磁粒子热疗)进行空间定向。理想的能对温度变化做出响应的热生物开关应该对急剧的温度变化具有灵敏的开关效果。热休克蛋白被迅速鉴定为真核细胞中已知的选择性和诱导性转录调控的最引人注目的例子。脂质介导的构象在不同温度下的变化导致膜相关蛋白的酶催化特性不同，这赋予膜相关蛋白具有温度感知特性。被称为“RNA温度计”的温度感应RNA分子，可以被设计成具有高灵敏度的灵活切换响应温度。此外，转录抑制因子，在生物医学相关的32-46℃范围内，对细菌基因表达的阈值提供开关式控制。

然而，上述响应温度变化的细胞内调节机制面临着一些固有的困难。温度是影响酶活性和复杂细胞代谢的重要因素，温度变化可能导致细胞代谢强度和代谢流量的变化，从而对靶途径产生不利影响。此外，体内不同合成途径之间的相互作用可能限制了对蛋白表达的有效控制。因此，人们正在寻找一种更有效的方法来避免不必要的代谢途径干扰温度控制途径。

无细胞蛋白合成(CFPS)体系是一个在体外合成活的有机体中应该已经产生且难以产生的蛋白质的平台。CFPS以外源DNA或mRNA为模板，在体系中补充无机盐、反应物质和能量底物。在细胞提取物提供的各种酶的作用下，蛋白质的合成可以在没有细胞环境的情况下进行。与细胞体系相比，CFPS可以避免细胞内代谢通路在不同温度下对目标代谢通路的干扰，提高温度调节通路的特异性。此外，无细胞体系的特点是其简单性和时间效率，作为一个开放的合成平台，没有膜的约束。它们只需要在生物合成反应中加入某些可以在几小时内完成的物质，从而可以快速探索和筛选出CFPS中对控制元素有关键影响的因素。此外，先前的研究已经表明，由物理信号控制的无细胞合成体系被封装在脂质体中，以模拟活细胞的种群通信，并且这种响应性人工细胞具有传递药物的潜力。

发明内容

本发明在CFPS体系中建立了响应温度的遗传回路，从而在体外通过温度控制蛋白质合成(图1)。热敏变体的噬菌体λ阻遏cI857(本发明中简称为cI)用于构建温控无细胞蛋白质合成(以下称为tcCFPS)体系，并完成重建质粒和优化细胞提取物与氧化还原条件。本发明还建立可以通过温度控制蛋白质合成的人工细胞。

具体地，提供了以下技术方案：

1.一种质粒，其包括：

编码温度敏感元件的基因；

位于所述编码温度敏感元件的基因下游的能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元；

位于所述操纵单元下游的表达目标蛋白的外源基因。