[发明专利]油菜BnLAC2基因在提高抗寒早花中的应用

说明书

本发明公开了油菜BnLAC2基因在提高油菜抗寒早花中的应用，设计了特异性靶向油菜BnLAC2基因的sgRNA，将其制成oligo二聚体并与Cas9骨架构建成基因编辑载体，通过农杆菌介导的遗传转化技术导入到甘蓝型油菜下胚轴愈伤并再生成苗，Cas9核酸酶在sgRNA的引导下将A基因组上BnLAC2基因编辑，产生插入突变，表型鉴定发现纯合突变株系寒害处理后油菜的生物量提高，并且提前两周开花。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及油菜BnLAC2基因在提高抗寒早花中的应用。

背景技术

油菜是中国第二大油料作物，仅次于大豆。它肩负着我国植物油供给的重任，所产菜籽油占国产油料作物产油的57％以上。目前中国油料作物自给率不足40％，每年仍需从国外进口大量油菜籽，因此油菜发展不仅对中国农业生产和国民经济有重要影响，而且对国家油料供应安全也具有重要意义。

我国冬油菜区油菜面积占全国油菜总面积90％以上，主要种植在长江流域，该地区以水稻种植为生产中心，实行稻油轮作的耕作制度。直播油菜适宜播期为10月中上旬，适期播种能保证油菜幼苗充分利用冬前温光资源达到较大的生物量，为越冬以后各生育期奠定基础。因此生长温度是影响油菜苗期生长、光合效率、产量的重要因素。目前由于优质稻生育期的延长，油菜的播种期推迟，导致越冬前油菜生长的有效积温下降，植株生长缓慢，容易遭受低温伤害。极端温度胁迫包括冷害(0-15℃)和寒害(0℃)胁迫，可导致作物光合作用减弱、生物量积累减缓、产量下降。为应对生产上播期推迟引起的不量影响，油菜抗寒性、早熟性已经成为育种家们关注的重点。

油菜是喜凉作物，但抗寒基因挖掘及分子机制研究相对较少，缺少关键的分子标记，油菜抗寒改良也迫切需要丰富的基因资源。漆酶是一类参与生物木质素代谢的酶类，遗传和生化研究发现该基因的表达可以激活一系列抗逆反应。突变该蛋白并进行功能性研究，为油菜早花抗寒性改良提供突变体资源。

发明内容

本发明的目的在于提供了油菜BnLAC2基因在提高油菜抗寒早花中的应用，利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑油菜BnLAC2基因可以有效提高寒害处理后油菜的生物量并提前两周开花。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种提高油菜抗寒早花的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑油菜BnLAC2基因，所述BnLAC2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，提高油菜抗寒早花的方法，包括以下步骤：

设计两条特异性靶向油菜BnLAC2基因的sgRNA，将其构建到含有Cas9的基因编辑骨架上，将基因编辑骨架构建到遗传转化载体上，通过农杆菌介导的遗传转化技术导入到甘蓝型油菜下胚轴的愈伤组织中，通过组织培养获得再生苗。Cas9核酸酶在两条sgRNA的引导下对BnLAC2的基因组序列进行编辑，通过对再生苗中BnLAC2基因序列测序，在两条sgRNA内部均发现碱基的插入突变。后续表型检测结果表明，纯合突变株系寒害处理后相比野生型油菜的生物量显著提高，开花期相比野生型油菜提前两周。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明首次从油菜中克隆到一个新的与开花期抗寒性相关的基因，将本发明所提供的基因在油菜中定点编辑后，抗寒鉴定结果表明BnLAC2的突变系在寒害处理下，生物量积累显著高于野生型。同时在正常条件下提早开花。本发明中BnLAC2突变体系的获得为早花抗寒品种的培育提供了珍贵的基因资源，对解析植物早花抗寒分子机制有重要意义。

附图说明

图1为BnLAC2基因的两个靶标位点。

图2为基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-MH(B)的示意图。