[发明专利]一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明提供了一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物化工技术领域。本发明分泌牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.45017和CGMCC No.45021。本发明糖蛋白PAG8单克隆抗体细胞株可用于食品安全检测中牛妊娠相关糖蛋白PAG8的分析检测。本发明提供两种杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对PAG‑8具有较好的特异性和检测灵敏度(ELISA方法灵敏度为2ng/mL)。且基于此对抗体制备的胶体金试纸条，可以快速、准确地检测到PAG‑8蛋白，灵敏度可达30ng/mL。

技术领域

本发明属于生物技术工程技术领域，尤其是指一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

对于奶牛养殖场来说，早期、准确的妊娠诊断是提高牛只繁殖效率，增加牧场经济效益的重要措施。传统的牛怀孕早期诊断的主要方法有观察法、直肠触诊法、超声波检测法、孕酮检测法等。其中观察法是观察牛的饮食等行为的变化，如饮食量增加、发情周期停止等。此方法依赖于观察人员的经验，且准确度难以保证，因此具有局限性。直肠触诊法和超声波检测法都要求特定人员的操作技术成熟和临床经验丰富，操作不当易对牛产生伤害，且超声检测需要专业设备。对于大规模的养殖场来说，这些方法耗时耗力，要求高，不具备广泛应用的条件。而孕酮检测法虽然简便快速，但是灵敏度和特异性达不到要求。

妊娠相关糖蛋白(PAGs)是反刍动物滋养细胞产生的一大类分泌型蛋白。在牛胚胎附植过程中，滋养层双核细胞与子宫上皮细胞融合，释放PAGs，通过母胎连接组织进入母体外周循环系统。目前已知的PAGs有22种，包括PAG1、PAG2、PAG4、PAG6、PAG8、PAG9等。有研究表明，奶牛体内的PAGs浓度与妊娠阶段是相关的，部分PAGs在妊娠早期含量升高明显，妊娠28天左右即可检测出，且含量在整个妊娠期间呈现总体上升趋势。这为牛怀孕早期诊断提供了有效方案。美国IDEXX公司研发生产的牛早孕检测产品是采用ELISA试剂盒的方法检测牛血清或EDTA血浆中的PAGs，准确率达95％以上，是当前应用最广的牛妊娠早期诊断产品。

基于免疫学原理的检测方法，是以抗体作为原料，检测待检样品中的目的抗原，因此制备出灵敏度高，特异性强的单克隆抗体是关键。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其胶体金试纸条应用。

一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株DIF，所述杂交瘤细胞株于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45017。

一种产生牛妊娠相关糖蛋白PAG8单克隆抗体的杂交瘤细胞株DMM，所述杂交瘤细胞株于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45021。

进一步的，所述杂交瘤细胞株DIF、DMM的制备方法，具体为：

S1：重组质粒构建：

根据GenBank公开的PAG-8基因序列(其中抗原PAG-8的基因序列见SEQ ID No.1)，以及氨基酸序列(SEQ ID No.2)，由无锡天霖生物科技有限公司负责优化和合成完整基因pCMV3-PAG8，之后转化至Trans10感受态细胞中，涂布平板培养。

S2：蛋白表达与纯化

从S1的平板中挑选单菌落接种至液体培养基培养，大提质粒转染HEK293细胞。细胞培养4-6天后，10000-12000xg离心20-30min收集上清液，采用Ni-NTA纯化系统纯化出目的蛋白PAG-8，PBS透析去除咪唑，NanoDrop One仪器测定浓度，-2至-30℃保存。