[发明专利]一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法

说明书

本发明公开了一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法，将生物基质中游离态和脂质体态艾立布林转移至固相萃取柱，经淋洗、洗脱后，使生物基质中游离态和脂质体态艾立布林分离。本发明基于选择合适填料的固相萃取柱、最优的淋洗试剂和洗脱试剂，达到分离生物基质中游离的艾立布林和脂质体态艾立布林的目的，最终能够支持生物基质中游离态艾立布林和总艾立布林的定量检测。使用本发明，游离态脂质体的回收率能够达到90%以上，基本满足了定量检测的需求。

技术领域

本发明涉及一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法，尤其涉及在临床前和临床实验中，需要定量检测生物体内的游离艾立布林和总艾立布林的研究，属于生物技术领域。

背景技术

艾立布林通过结合vinka生物碱结合域而产生细胞毒性，进而引起球状微管蛋白聚集，导致有丝分裂过程中止及细胞死亡。疗效试验已经证明，艾立布林对许多类型的肿瘤如乳腺癌、尿路上皮肿瘤、前列腺癌及非小细胞肺癌(包括经多次抗微管药物既往治疗的患者)有治疗活性。但是艾立布林的剂量限制性毒性主要是骨髓抑制和嗜中性粒细胞减少，还包括其他的非血液性毒性事件包括疲劳、恶心、脱发。降低艾立布林的毒性，降低给药频率，提高患者顺应性是推动艾立布林研发的一个重要方向。

脂质体(Liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。利用脂质体包裹艾立布林即能达到降低毒性的目的，有延长了药物在人体内的半衰期，从而有效降低了给药的频率。

利用脂质体给药，游离药物是其直接发挥药效或毒性的成分，对生物基质中游离成分艾立布林的定量检测能够更加直观的反应药效与药代动力学以及毒性与毒代动力学之间的关系。目前分离游离艾立布林的方法主要是超高速离心法。在355040g的离心力下离心4小时，达到分析游离态艾立布林的目的。此方法对离心机要求非常高，一般实验室不具备条件，样品处理时间特别长，不适合大批量的临床\临床前试验。现在的试验非常需求一种快速、便捷的分离游离态艾立布林的方法。

发明内容

本发明的目的旨在提出一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法，以满足此生物基质中游离成分艾立布林的定量检测需求，该方法操作简单快速，操作性强。

为实现上述目的，本发明提供一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法，将生物基质中游离态和脂质体态艾立布林转移至固相萃取柱，经淋洗、洗脱后，使生物基质中游离态和脂质体态艾立布林分离。

进一步地，所述固相萃取柱为聚乙烯吡咯烷酮固相萃取柱。

进一步地，所述淋洗采用纯水淋洗剂，所述洗脱采用甲醇、异丙醇或乙腈洗脱剂。

进一步地，所述纯水淋洗剂的体积为0.8-1.2mL，所述洗脱剂体积为≥0.3mL。

进一步地，所述固相萃取柱规格为30mg/1mL、60mg/3mL、150mg/6mL、200mg/6mL和500mg/6mL。

进一步地，在上样前和淋洗前分别用不小于0.1mL的血浆平衡固相萃取柱。

进一步地，所述生物基质为血浆、血清、全血、排泄物和组织匀浆液中的一种。

进一步地，具体包括：首先使用1mL的2-8℃预冷甲醇活化固相萃取柱→1mL的2-8℃预冷超纯水活化固相萃取柱→0.1mL的2-8℃预冷血浆平衡固相萃取柱环境→，转移0.1mL的游离艾立布林和脂质体艾立布林的生物基质样品至固相萃取柱→待样品完全被固相萃取柱吸收后，使用0.1mL的2-8℃预冷血浆进行平衡→使用0.5mL的2-8℃预冷超纯水淋洗固相萃取柱2次→用0.3mL的2-8℃预冷甲醇对固相萃取柱进行2次洗脱，合并收集洗脱液→室温条件下氮气吹干洗脱液，并用0.3mL含0.1％FA的20％乙腈进行复溶，转移2μL至液质联用仪定量分析。