[发明专利]一种创制早熟玉米种质的方法及其应用

说明书

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种创制早熟玉米种质的方法及其应用。本发明首先提供了用于创制早熟玉米种质的sgRNA，其包括：序列如SEQ ID NO.1所示的特异性靶向玉米基因ZmCCT10的sgRNA。本发明所提供的sgRNA和CRISPR/Cas9敲除载体可以显著提高对玉米基因ZmCCT10的打靶效率，有效降低玉米的光周期敏感性，并提早玉米的开花时间，从而能够快速创制早熟玉米种质。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种创制早熟玉米种质的方法及其应用。

背景技术

基因组编辑是一种对基因组进行定向精确修饰的技术，主要包括锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(TranscriptionActivator-Like Effector Nucleases，TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatednuclease，CRISPR/Cas)。CRISPR/Cas系统大致分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3类，其中II型系统的组成比较简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA 3种成分即可发挥作用，且具有高效性和易操作性，成为目前应用最广泛的基因组编辑系统。II型CRISPR/Cas系统的特征蛋白为Cas9，Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个核酸酶结构域,该结构域负责切割靶DNA的两条链，从而造成靶DNA双链断裂。其中HNH结构域负责切割与crRNA互补的DNA链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif,PAM)上游3bp处，RuvC结构域则负责切割非互补链，切割位点位于PAM上游3–8bp处。Cas9蛋白同时具有加工产生crRNA以及切割外源核酸的功能。crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，研究者可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA(gRNA)或者将两者融合在一起形成单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)。sgRNA能够与Cas9核酸内切酶结合并将Cas9引导至基因组上对靶位点进行切割。CRISPR/Cas9系统使目标基因DNA产生双链断裂，激活细胞内的DNA损伤修复机制，进而产生缺失、敲入等变异。目前，CRISPR/Cas9系统已被迅速地用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得了较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。

玉米(Zea mays L.)是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品和化学工业的原料。其正常花序由雌穗和雄穗两部分组成，发育阶段大致分为两步：开花期的转换以及花的发育，具体发育可分为三个阶段开花诱导(The floral induction phase)、花原基形成(Thefloral primodia phase)和花器官发育(The floral organs development phase)，相对应的调控基因包括：开花时间基因(Flowering time genes)、分生组织特征基因(Metristem identity genes)和花器官特征基因(Organ identity genes)。其中开花诱导至关重要，开花时间对玉米成熟的早晚以及种质的发育具有显著的影响作用。玉米基因组感受光周期的CONSTANS like基因--ZmCCT家族成员众多，其中数个ZmCCT家族成员，如ZmCCT10、ZmCCT9、以及ZmCol3等被分别证明为感受光周期信号传导的CONSTANS like基因，具有较强光周期反应生物学效应的主效基因。

此外，CN104869808A公开了控制玉蜀黍和高粱的光周期敏感性的基因以及所述基因的用途，并提到了ZmCCT10多肽包含CONSTANS、CONSTANS-LIKE、TOC1(CCT)结构域，通过下调编码上述结构域的多肽的内源性基因的表达，可以降低植物的光周期敏感性。不过，上述的结构域主要指ZmCCT10基因的启动子区域。

发明内容