[发明专利]一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用

说明书

本发明公开了一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用，属于分析检测领域。本发明通过RCA反应制备三维功能核酸，三维功能核酸结构中包含焦磷酸镁，利用碱性磷酸酶可以将焦磷酸镁水解为可溶性磷酸镁的作用特点，在数分钟内，三维功能核酸结构坍塌，释放被控的蛋白酶，在比色纸芯片加入TMB/H₂O₂显色底物后发生反应，产生颜色变化，显色深浅与待测物的含量成正比，整个检测过程约25min，检测成本低廉；本发明可应用于铜绿微囊藻藻液ALP活性检测，将藻液过膜处理后滴加于反应区，可通过显色深浅反映铜绿微囊藻藻液中ALP活性。本发明步骤简单、耗时短，不需大型分析仪器，可实现对待测物的快速现场定量检测。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用，尤其涉及所述纸基器件在铜绿微囊藻藻液ALP检测中的应用。

背景技术

三维功能核酸是一类在生物技术领域极具应用潜力的材料，其具有较大的负载能力，其可以负载信号蛋白分子作为一种控释材料，基于三维功能核酸的响应型控释材料是一类新型的纳米材料，在生物传感器方面受到了特别的关注，当目标物存在时释放货物分子，产生检测信号，蛋白酶作为高效催化剂具有信号放大的作用，可以实现快速、灵敏的检测。这种材料同时还具有良好的生物相容性以及较高的稳定性，在生物传感器及药物递送方面都受到了特别的关注。

生物酶可以对检测信号进行放大，但是将纳米控释材料与生物酶结合时，由于蛋白质与材料的相互作用力较强，释放速度慢，将其用于分子的即时检测较困难。据知，目前关于蛋白质快速释放的控释材料的研究较少。

DNA纳米结构由于可编程性强使得其在多个领域显示了巨大的应用前景。近年来，由于三维功能核酸(3D DNA)具有高度有序和灵活的多孔结构，已被用于蛋白质包覆；但是其释放的应用和研究较少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于蛋白酶控制释放的比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件及其制备方法与在铜绿微囊藻藻液ALP检测中的应用。用于负载蛋白酶的3D DNA结构(protein@3D DNA)中包含了可被待测物质水解的焦磷酸镁，利用待测物质将焦磷酸镁水解为可溶性磷酸镁盐的变化，在数分钟内，释放负载的蛋白酶，实现碱性磷酸酶的快速传感及信号放大检测。

本发明的技术方案为：

一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件，所述纸基器件由包括反应区Z1区和检测区Z2区的两层纸芯片构成，所述反应区Z1区封闭处理后，负载了由焦磷酸镁与DNA骨架组成的三维功能脱氧核糖核酸，所述三维功能核酸包裹蛋白酶，所述检测区Z2区负载了3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

进一步地，上述技术方案中，所述纸基器件包括反应区器件和检测区器件，所述反应区器件上设有反应区Z1区，所述检测区器件上设有检测区Z2区，将反应区器件和检测区器件在竖直方向上重叠后，所述反应区Z1区与检测区Z2区在竖直方向上相对应，所述反应区Z1区和检测区Z2区均为亲水区，所述反应区器件上除了反应区Z1区以外的部分以及检测区器件上除了检测区Z2区以外的部分均为疏水区。

进一步地，上述技术方案中，所述反应区Z1区的材质包括NC；检测区Z2区的材质包括FF120HP；所述反应区Z1区的面积≤检测区Z2区的面积。

进一步地，上述技术方案中，所述蛋白酶包括辣根过氧化物酶HRP。

进一步地，上述技术方案中，包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸的制备方法，包括以下步骤：

a)SEQ ID NO.1所示的线性DNA模板环状化，得到环状DNA模板，纯化环状DNA模板，并将纯化的环状DNA模板溶于无酶无菌水中；