[发明专利]一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法

权利要求书

1.一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，其特征在于，人血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体包括以下步骤：

(1)血浆样品预处理：

室温黄光条件下，以EDTA-K₂为抗凝剂，以匹伐他汀-d4为内标；在96孔板的孔中加入100μL样品，加入50μL浓度为20.000ng/mL的内标匹伐他汀-d4工作溶液，混匀后每一个样品孔中加入400μL乙腈，封板，混匀5min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液150μL至另一96孔收集板中，加入150μL含有50％乙腈和0.005％乙酸的溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，获得测试样品，待进样；

(2)试样测定：

室温黄光条件下，取5μL测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的匹伐他汀和内标匹伐他汀-d4的色谱峰，并据此计算人血浆样品中的匹伐他汀浓度。

2.根据权利要求1所述的一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中：

液相色谱条件为：

色谱柱：WelchUltimateXB-C₁₈，柱规格为2.1×150mm，5μm；

色谱柱温：40℃；

流动相A：水/乙酸的体积百分比为100/0.05；流动相B：乙酸/乙腈的体积百分比为0.01/100；

洗针液：水/乙腈/乙酸的体积百分比为20/80/0.05；

自动进样器温度为4℃；

梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为5μL，分析时间5.5min；

质谱条件为：

离子源为电喷雾离子源，接口电压为4000.00V，接口温度为300℃，DL温度230℃，加热块温度为400℃，CID气为230Kpa；

匹伐他汀和匹伐他汀-d4的碰撞能量分别为-29V和-30V，正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。

3.根据权利要求2所述的一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中，洗脱程序为：

4.根据权利要求1所述的一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中：采用内标法，以匹伐他汀和内标匹伐他汀-d4的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的匹伐他汀的浓度。

5.根据权利要求4所述的一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，其特征在于，

标准曲线方程的建立包括以下步骤：

取190μL空白血浆置于聚丙烯管中，以工作液的形式分别添加10μL浓度分别为4.000ng/mL、8.000ng/mL、40.000ng/mL、160.000ng/mL、320.000ng/mL、640.000ng/mL、1280.000ng/mL、1600.000ng/mL的匹伐他汀工作溶液，再以体积比为1:1加入0.1mol/L乙酸钠缓冲液的稳定剂至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8中，混匀后分别取100μL标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本加入50μL的20.000ng/mL的内标匹伐他汀-d4溶液，向双空白样本中加入50μL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后每一个样品孔中加入400μL乙腈，封板，混匀5min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液150μL至另一96孔收集板中，加入150μL含有50％乙腈和0.005％乙酸的溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，获得标准样品，待进样；

分别取5μL标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的匹伐他汀和内标匹伐他汀-d4的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于回算所述血浆样品中的匹伐他汀的浓度。

6.根据权利要求1所述的一种液质联用测定血浆中匹伐他汀浓度的方法，其特征在于，质量控制的建立包括以下步骤：

配制匹伐他汀和匹伐他汀内脂浓度均为4.000ng/mL、12.000ng/mL、60.000ng/mL、600.000ng/mL、1200.000ng/mL的质控样品工作液；取380μL空白血浆置于聚丙烯管中，分别添加质控工作液20μL，再以体积比为1:1加入0.1mol/L乙酸钠缓冲液的稳定剂，混匀后分别取质控样品100μL加入50μL的20.000ng/mL的内标匹伐他汀-d4溶液，混匀后每一个样品孔中加入400μL乙腈，封板，混匀5min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液150μL至另一96孔收集板中，加入150μL含有50％乙腈和0.005％乙酸的溶液，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，获得标准样品，待进样；

分别取5μL标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测质控样品中的匹伐他汀和内标匹伐他汀-d4的色谱峰，并根据标准曲线回算出质控样品测定浓度。