[发明专利]一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法

说明书

本发明涉及一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，所述仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法包括以下步骤：选取一株发病仙客来的叶柄并剪为多个长5mm的叶柄段；对所述叶柄段进行杀菌消毒；将杀菌消毒后的所述叶柄剪为3‑5mm的组织块放入PDA培养基上培养，直至长出无杂菌；挑取所述无杂菌的边缘白色菌丝，接入加入了细菌抑制剂羧苄青霉素的PDA液体培养基中进行培养；吸取培养后的菌液到进行稀释10^‑5倍，吸取稀释后的菌液涂布到PDA固体培养基上得到纯化的病原菌的单一菌落。本发明提供的方法对病原菌分离的组织消毒彻底，对内生细菌的抑制效果极好，分离纯化率高，降低了目标病原菌与其它微生物的混合机率，大大减少了纯化的次数。

技术领域

本发明属于细菌纯化技术领域，尤其涉及一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法。

背景技术

枯萎病是仙客来主要的一个真菌病害，发病率在35％左右。病菌以菌丝体、分生孢子、厚垣孢子随病株残体在土壤中越冬。菌丝体可在土壤中腐生存活3年，此病具有潜伏隐蔽、发生突然、蔓延迅速、致死率高的特点，但随着仙客来大范围种植及规模化生产，病害发生也逐渐加重，严重影响仙客来欣赏性和商品性。分离纯化该病病原菌获得纯培养物是开展各项研究的基础。

仙客来枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌，通过在植物体内破坏维管束组织，使植物叶片黄化、萎蔫，最终枯萎死亡，需采用传统的组织分离的方法进行病原菌的分离，由于仙客来植株是肉质，组织水分含量高，内生细菌比较多，采用常规的无菌水、75％的酒精进行表面消毒无法彻底杀死内生细菌，植物组织放置在培养基中培养病原菌，植物组织内的细菌污染严重，常常会导致病原菌分离效率低，甚至分离失败。所以在组织分离中，需要开发一种严格的植物组织消毒及内生细菌的抑制技术，从而提高病原菌的分离效率。

因此，有必要提供一种新的仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法解决上述技术问题。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法，包括以下步骤：

S1：选取一株发病症状明显且处于发病中期的仙客来，选取其发黄程度为25％-35％的叶子作为样品叶；

S2：将所述样品叶洗净风干后剪去叶片留下叶柄，再将所述叶柄的两端去除，剩下部分剪为多个长5mm的叶柄段；

S3：对所述叶柄段进行杀菌消毒，包括以下步骤：

将所述叶柄段放入烧杯中并加入纯净水；

向所述烧杯中加入洗洁精和消毒液各0.15-0.25ml；

将所述烧杯口用纱布封好；

将封好口的所述烧杯用纯净水不断的冲洗，冲洗时间至少为30min，直至无泡沫产生；

将所述烧杯中的所述叶柄段拿出并放入无菌水清洗；

将清洗后的所述叶柄段用75％酒精浸泡30s；

将酒精浸泡后的所述叶柄段再用无菌水漂洗1min；

将漂洗后的所述叶柄段用0.1％HgCl浸泡1min；

最后用无菌水将所述叶柄段漂洗，完成后晾干备用；

S4：将杀菌消毒后的所述叶柄段两端切去，形成长度为3-5mm的组织块，将所述组织块放入PDA培养基上培养，直至长出无杂菌；

S5：挑取所述无杂菌的边缘白色菌丝，接入加入了50μg/L细菌抑制剂羧苄青霉素的PDA液体培养基中进行培养；