[发明专利]pAdM3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法

权利要求书

1.一种胰腺导管细胞分离培养基，其特征在于：包括培养基a、培养基b和培养基c，其中，

培养基a为含10vol%FBS的CMRL1066培养基；

培养基b为含0.02vol%大豆胰酶抑制剂、10vol%FBS、100μg /ml Pen Strep的CMRL1066培养基；

培养基c为含20 ng /ml EGF、10 ng /ml KGF、10 mM烟酰胺、25 mM Glucose、100μg /ml Pen Strep、10vol%FBS的DMEM / F12培养基。

2.一种密度梯度离心分离胰岛细胞的分离液，其特征在于：包括分离液A、分离液B和分离液C，其中，

分离液A由Biocoll分离液与Hanks液按体积比为20:1的比例混合配制而成，密度为1.096 g/ml；

分离液B由分离液A与Hanks液按体积比为6.4 : 1.1的比例混合配制而成，密度为1.085g/ml；

分离液C由分离液B与Hanks液按体积比为2.4: 2.6的比例混合配制而成，密度为1.051g/ml。

3.pAd-M3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）使用Biocoll分离液通过密度梯度离心分离胰岛细胞：利用密度梯度离心分离胰岛细胞的分离液分离胰岛细胞；

（2）胰腺导管细胞分离；利用胰腺导管细胞分离培养基分离胰腺导管细胞；

（3）利用腺病毒pAd-M3C进行转分化诱导：腺病毒pAd-M3C感染步骤（2）分离的胰腺导管细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）包括以下具体步骤：

1)加分离液A液于胰岛中，轻轻混匀，小心勿起气泡；

2)再沿离心管壁缓慢依次加入分离液A、分离液B和分离液C，三种分离液的体积比为1:1:1，小心保持界面，轻拿轻放；

3)4℃离心，400 rpm，3 min后稳定加速至1700 rpm，14 min，无刹车减速；

4)用玻璃吸管吸取交界面细胞团入新的15ml离心管中，加入4℃预冷的洗液至10 ml，1000 rpm，1 min，4℃离心，弃上清，重复洗涤3次，获得移除胰岛细胞后，含有腺泡和导管细胞的沉淀；

5)洗涤后的细胞沉淀用2 ml洗液重悬置于培养皿中；

所述洗液为含0.1wt% BSA 的Hanks液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）包括以下具体步骤：

1) 重悬：步骤（1）获得的移除胰岛后，含有腺泡和导管细胞的沉淀加入装有20 ml PBS的50 ml离心管中，在室温下自然沉降10 min，弃上清，以除去包括死细胞的低密度组分；

2)清洗：加入20 ml PBS，1000 rpm，1min，弃上清，清洗5次；

3)消化：沉淀中加入10 ml的0.025wt％胰酶，涡旋振荡15 s 37℃孵育5 min，将外分泌组织解离成单细胞；

4)终止消化：加入10 ml预冷的培养基a，用移液器上下吹打混匀终止消化；

5)过滤：用PBS湿润30 ~ 40 μm滤器，过滤入50 ml离心管；

6)离心：1000 rpm，1min，弃上清，细胞沉淀用5ml培养基b重悬；

7)细胞计数；

8)布板：细胞计数后，用培养基b补齐，1.0×10⁵/ml接种于胶原蛋白包被过的6孔板上；

9)培养：37℃，5% CO₂，培养2天；

10)换液：第3天，将培养基换成培养基c，至第7天形成贴壁的单层上皮细胞，而大部分初始腺泡细胞在此阶段死亡；超过95％的贴壁细胞表达导管细胞特异性标记泛细胞角蛋白；

11)传代：根据细胞状态在第10天左右，1:2传代，每2天换液，传3~5代后开始后续实验。