[发明专利]一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌为转化了重组表达质粒pNZ8149-Hsp70的乳酸乳球菌；其中，所述热休克蛋白Hsp70的基因序列如SEQ ID No.1所示，所述重组乳酸乳球菌表达的Hsp70重组蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种如权利要求1所述的表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.扩增Hsp70基因全序列，制备pNZ8149线性化载体，将所述Hsp70基因全序列与所述线性化载体进行同源重组连接反应，得到重组表达质粒pNZ8149-Hsp70；

S2.制备感受态细胞，将所述重组表达质粒pNZ8149-Hsp70通过电转化转入所述感受态细胞，制得所述重组乳酸乳球菌。

3.根据权利要求2所述的一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述扩增Hsp70基因全序列包括以下步骤：根据猪Hsp70全基因序列及乳酸菌质粒pNZ8149的同源臂设计Hsp70引物，并在上游引物和下游引物分别添加酶切位点；提取猪肾细胞总RNA，通过反转录得到cDNA后再进行PCR扩增以及胶回收得到Hsp70目的基因。

4.根据权利要求2所述的一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述制备pNZ8149线性化载体包括以下步骤：提取pNZ8149质粒载体并对其进行双酶切消化，回收酶切产物，之后进行反向PCR扩增，对PCR产物进行回收获得pNZ8149线性化载体。

5.根据权利要求2所述的一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述制备感受态细胞包括以下步骤：取乳酸乳球菌NZ3900接种、培养，待培养至OD_600nm＝0.2-0.3，收集菌体沉淀；使用SolutionⅠ或SolutionⅡ多次重悬菌体，冰上静置，离心，弃去上清，将残留液体彻底吸干后，加入SolutionⅠ重悬沉淀，获得所述感受态细胞。

6.根据权利要求2所述的一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述电转化包括以下步骤：取感受态细胞和经过预处理的重组表达质粒pNZ8149-Hsp70在预定条件下进行电转化，电转化结束后立即加入电转复苏液，静置，取出电转化产物，离心，弃去部分上清，重悬菌体沉淀，获得所述重组乳酸乳球菌。

7.根据权利要求2所述的一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，还包括步骤：对所述重组乳酸乳球菌进行扩增并进行鉴定，具体包括步骤：将菌体沉淀重悬之后涂布于平板中培养，挑取黄色菌落接种、培养至浑浊，提取质粒进行PCR鉴定，获得构建成功的重组乳酸乳球菌；和/或，

还包括步骤：对所述重组乳酸乳球菌进行诱导表达，具体包括步骤：挑取构建成功的重组乳酸菌单菌落，接种、培养至OD_600nm＝0.6，加入诱导剂Nisin至预定终浓度，静置诱导，诱导结束后，将产物离心收集菌体沉淀，洗涤菌体，重悬菌体沉淀并冻存，反复冻融之后超声破碎，上清液经超滤管浓缩，收集超滤后的浓缩液，分别检测上清和沉淀中Hsp70蛋白的表达。

8.一种含有权利要求1所述的表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌的产品。

9.一种如权利要求1所述的表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌或其制备方法在制备缓解、抑制、预防或治疗动物摄入毒素中毒的产品中的应用，其特征在于，所述动物摄入毒素包括伏马菌素和/或赭曲霉毒素。