[发明专利]一种用于检测SARS-CoV-2 69:70del位点的方法

说明书

本发明公开了一种用于检测SARS‑CoV‑2 69:70del位点的CRISPR‑Cas13a系统及其使用的crRNA。该系统包括Cas13a蛋白和crRNA；SARS‑CoV‑2 69:70del位点的靶点序列位于SARS‑CoV‑2基因组第21753‑21786位，并缺失tacatg 6个碱基；SARS‑CoV‑2 69:70del位点的crRNA序列如SEQ ID NO:3所示。实验证明，本发明提供的crRNA可通过激活Cas13a实现对SARS‑CoV‑2 69:70del位点核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到单拷贝（1copy/test）。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种用于检测SARS-CoV-2 69:70del位点的CRISPR-Cas13a系统及其使用的crRNA。

背景技术

COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）所引起的疾病。随着时间的推移，SARS-CoV-2出现了多种新的值得关注的变异株（VOCs）。B.1.1.7 谱系（VOC202012/01， 501Y.V1）首先出现在英格兰南部，这个谱系的特征在于17个突变，包括14个氨基酸替换和3个位于ORF 1 a/b，ORF8，Spike（S）和N基因区域2的框架内缺失。而位于S基因区中的69:70del已被证明具有潜在的生物学意义。69:70del是SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike protein，S蛋白）n端结构域（ntd）中的第69位的组氨酸（h69）和第70位的缬氨酸（v70）缺失突变，69:70del 可引起 S蛋白 S1亚基构象改变。目前已有研究表明，69:70del主要与造成免疫逃逸的突变位点同时出现，增强病毒的细胞感染力。此外，基于目前的监测数据69:70del 还常与位于S蛋白的N501Y、N439K 以及 Y453F 突变同时出现。已有研究证明，利用假病毒模拟B.1.1.7变异株S 蛋白的氨基酸突变，69:70del的B.1.1.7病毒变异株对细胞的感染力显著增强。研究显示，69:70del增强病毒感染力的机制可能是通过增加病毒粒子表面 S 蛋白密度来实现的。目前，对SARS-CoV-2变异株的检测方法主要有两种。第一种方法，即目前主要采用的方法，是基因测序方法，主要包括一代测序和下一代测序。尽管这种技术对于识别新变异很重要，并且能够实时跟踪VOC，但它非常耗时，并且需要大量的数据分析，且无法在所有实验室中进行。其他检测方法主要是基于RT-qPCR进行检测，尽管比基因测序方法更快，但其样本处理复杂，且对仪器精度要求高。

2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级（单拷贝）、特异性达到单碱基的核酸检测技术—基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK（Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白（LwCas13a）的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。研究表明，Cas13a可用于生物样本（血液或尿液）中寨卡以及登革热病毒的鉴定，并进一步区分非洲毒株和美洲毒株的基因序列，还可用于鉴定细菌的特定类型。而其在鉴定病毒或细菌核酸之后，通过设计特异的crRNA可以直接用于病原体的分型，其超高的灵敏度避免了大量复杂的上游实验工作，即可直接扩增生物样本进行检测，缩短了样品的前处理过程。由此可见，该技术在基础研究、诊断和治疗领域的巨大应用前景。

发明内容

本发明的目的在于将PCR技术与基于Cas13a蛋白的CRISPR结合，通过设计、构建、筛选，最终提供一段能靶向SARS-CoV-2 69:70del位点，并激活CRISPR-Cas13a系统的crRNA，利用该靶点构建的CRISPR-Cas13a系统能够特异性地检测SARS-CoV-2 69:70del位点。