[发明专利]多模态示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种多模态示踪脐带间充质干细胞，其特征在于，所述多模态示踪脐带间充质干细胞过表达FTH1蛋白和SR39TK蛋白。

2.根据权利要求1所述的多模态示踪脐带间充质干细胞，其特征在于，所述多模态示踪脐带间充质干细胞中还修饰有EGFP报告基因。

3.一种如权利要求2所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供脐带间充质干细胞；

2)将rFTH1-T2A基因连接到载体pLVX-EGFP上，得到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP；然后将P2A-SR39RK基因连接到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP上，构建得到多模态慢病毒表达载体pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP；

3)慢病毒包装，获得含有FTH1、SR39TK、EGFP基因的重组慢病毒；

4)用重组慢病毒转染脐带间充质干细胞，构建得到修饰有FTH1、SR39TK、EGFP基因的多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。

4.根据权利要求3所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括：

1-1)脐带处理：洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；

1-2)将培养基置于37℃下培养；

1-3)消化传代：

1-3-1)细胞培养至80％-90％融合率时，进行消化传代；

1-3-2)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗；

1-3-3)加入0.25％的Trypsin，于37℃恒温箱中消化1-2min；

1-3-4)吸去Trypsin，加培养基终止消化并将细胞吹打均匀；

1-3-5)将细胞悬液转移到离心管中，离心，吸去上清，留沉淀；

1-3-6)向沉淀中加入培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养。

5.根据权利要求4所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括：

2-1)扩增rFTH1-T2A基因片段：以含有rFTH1-T2A基因的质粒作为模板，用如下引物对通过PCR扩增出rFTH1-T2A基因片段，并在rFTH1-T2A基因片段两端分别引入XbaI和AgeI酶切位点；

PRTE-F：

5’-CGGTGAATTCCTCGAGACTAGTTCTAGAGCCACCATGACCACCGCGTCT-3’；

PRTE-R：

5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGATACCGGTAGGGCCGGGATTCTCCTCCA-3’；

2-2)以pLVX-EGFP质粒为载体，使用XbaI和BamHI酶切后备用；

2-3)同源重组连接：步骤2-1)得到的rFTH1-T2A基因片段与步骤2-2)得到的载体在同源重组酶的作用下连接，得到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP；

2-4)在P2A-SR39RK基因片段两端分别添加5'BamHI和3'BamHI，然后克隆至步骤2-3)得到的载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP中，得到多模态慢病毒表达载体pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP。