[发明专利]快速分离纯化尾孢菌以及抗药性检测的方法

说明书

本发明公开了快速分离纯化尾孢菌以及抗药性检测的方法。分离纯化尾孢菌菌株采用振荡洗脱病斑上分生孢子的方法，简便易行，不需要在显微镜下进行操作，同时省略了对植物样品进行清洗和表面消毒的步骤，缩短了真菌分离的时间，避免了因表面消毒过度可能造成病原菌杀灭的风险；同时能有效的排除其他病原菌的干扰，提高了尾孢菌分离的准确率。筛选抗药性尾孢菌的方法显著提高了抗药性检测的效率，直接在带药平板上进行筛选，节省了传统抗药性检测必须先进行病原菌分离纯化的过程，节约了时间和试验材料，更加简便快捷。本发明提供的方法适用于尾孢菌属真菌对大田常用杀菌剂的快速、简便的抗性检测，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及快速分离纯化尾孢菌以及抗药性检测的方法。

背景技术

尾孢菌属(Cercospora)是无性型真菌丝孢纲中的一个大属，广泛分布于热带和温带地区，目前已报道尾孢菌3000多种。尾孢菌属真菌能侵染多种农作物和经济作物，在植物的叶、茎、花、果实和种子等各部位上寄生，引起明显的坏死斑。农业生产中重要的尾孢属真菌有引起甜菜褐斑病的甜菜尾孢、造成烟草蛙眼病的烟草尾孢、引起大豆紫斑病的菊池尾孢、引起芹菜疫病的芹菜尾孢以及引起玉米灰斑病的玉米尾孢和玉蜀黍尾孢。尾孢菌引起的病害发生严重时病斑连片，导致叶片快速干枯、脱落，造成重大经济损失，如甜菜褐斑病通常病田减产10％-20％，含糖量下降1％-2％，严重时减产达30％-40％，含糖量下降3％-4％，甚至绝收。

目前针对尾孢属真菌病害的田间防治是种植抗病品种和化学防治。化学防治主要利用保护性和内吸性杀菌剂。保护性杀菌剂要包括二硫代氨基甲酸盐类、取代苯类等；内吸性杀菌剂包括苯并咪唑类、甲氧基丙烯酸类、甾醇脱甲基化酶抑制剂等。其中苯醚甲环唑、氟硅唑、吡唑醚菌酯、代森锰锌是目前生产上较常规、有效防治甜菜褐斑病的四种药剂。然而大范围高剂量使用杀菌剂容易使尾孢菌产生抗药性，如1990年希腊报道甜菜尾孢菌对DMI类杀菌剂敏感性降低并发现了抗药性菌株，美国连续多年监测甜菜尾孢菌对甲氧基丙烯酸酯类的抗药性，表明2011年田间抗性菌株的比例较1998年有大幅度的提升。因此，对田间病原菌群体持续地大范围抗药性监测显得极为重要，对田间病害的科学防治具有指导性意义。

病原菌的分离与纯化是开展病原菌致病性、病原与寄主互作以及病原菌对杀菌剂的敏感性和抗药性等研究的基础。植物病原真菌分离和纯化的常规方法是组织分离法，主要步骤是选取病健交界处的植物组织，经过表面消毒后放置在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中培养，一般3-4天可在病组织周围形成菌落，再用接种针挑取菌落边缘小块转移至新的培养基中，在合适的条件下培养并诱导产孢，进一步收集孢子配制成一定浓度的孢子悬浮液涂布水琼脂平板，12h待孢子萌发后用挑针挑取单个孢子进行培养，从而获得该菌的纯培养物用于后续的研究。该方式适用于菌丝生长较快、易产孢的病原真菌，如梨孢属、平脐蠕孢属、凸脐蠕孢属、青霉属、镰刀菌属和链格孢属等。

尾孢菌属真菌在PDA培养基上生长缓慢，组织分离培养的时候容易被生长较快的真菌污染，比如甜菜褐斑病叶片分离病原菌的时候常常受到链格孢菌的影响。同时尾孢菌在常规的培养基上很难产孢，需要利用特殊培养基在高湿和紫外光诱导下生长2周以上才能产孢。因此，常规组织分离法并不适用尾孢菌的分离和纯化。目前尾孢菌的纯化主要是利用挑针直接挑取病斑上产生的分子孢子或者用含0.06％Tween-20的灭菌水反复冲洗病斑，获得分子孢子后涂布于水琼脂平板，待孢子萌发后用挑针挑取单个孢子进行培养。该方法需要在显微镜下利用挑针挑取单孢子，实际操作难度较大并且依赖于显微镜设备，并且每次只能随机挑取有限的菌株进行后续的药剂敏感性和抗药性测定，所得到的结果并不能很好地反应田间整个病原菌群体的情况。因此，需要建立一种快速、简便的尾孢菌分离纯化以及抗药性检测的方法。

发明内容

本发明的第一个目的是快速分离纯化尾孢菌菌株。

本发明首先保护一种分离纯化尾孢菌菌株的方法，包括如下步骤：

(A1)取含有尾孢菌病斑的植物组织，收集尾孢菌病斑组织；