[发明专利]一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱、检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种水蛭酶解多肽的LC‑MS特征图谱，包括52个多肽成分色谱峰。本发明还公开了一种水蛭酶解多肽的LC‑MS特征图谱的检测方法及其在水蛭药材及含水蛭制剂质量控制中的应用和在水蛭、蚂蟥鉴别中的应用。本发明通过水蛭酶解多肽成分的整体表征进行药材质量控制，具有较高的准确性和专属性；本发明建立表征水蛭酶解多肽成分的特征图谱，能够具有更好的专属性和药效相关性，能够保障水蛭药材的临床疗效，本发明通过与水蛭其它基原动物蚂蟥比较，本发明的特征图谱能够有效区别两种水蛭基原，从而有效解决水蛭药材的基原鉴别及真伪鉴别的问题，为水蛭药材的鉴别提供了准确评价方法。

技术领域

本发明涉及一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱、检测方法及其应用，属于中药质量控制技术领域。

背景技术

传统中药水蛭始载于《神农本草经》，2020年版《中国药典》规定水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmaniaacranulata Whitman的干燥全体。唐代《新修本草》记载：“大者长尺，名马蛭，一名马蜞，并能咂牛、马、人血；今俗多取水中小者用之，大效，不必要须食人血满腹者”。宋代《本草图经》记载：“水蛭有长尺者，用之当以小者为佳。”本草古籍记载的优质水蛭药材与《中国药典》中规定的水蛭科动物水蛭Hirudo nipponica Whitman相一致（张卫,等.中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨[J].中国中药杂志,2013,38(6):914-918.）。本发明以此水蛭为对象，建立了一种水蛭药材的质量控制方法。

中药水蛭具有破血、逐瘀、通经的功效，用于治疗蓄血、症瘕积聚、妇女经闭、干血成痨、跌打损伤等。水蛭作为动物药，其含有的活性蛋白或多肽成分被认为是其主要有效成分，早在1955年就从水蛭唾液中分离得到一种由65个氨基酸残基组成的多肽-水蛭素（Hirudin），是迄今发现的最强的凝血酶抑制剂。然而，传统中药水蛭为其干燥体，至今未见从水蛭药材中发现水蛭素的报道，推断水蛭药材中另有其它未知的活性蛋白或多肽成分。传统中药水蛭为口服给药，口服后在胃肠道经消化酶酶解后被吸收进入体内，发挥其功能。已有研究报道，水蛭胃蛋白酶酶解物具有比水提物、醇提物及其它蛋白酶酶解物更优的纤溶作用（李濯冰，等。水蛭不同工艺提取物抗凝与纤溶活性比较及酶解物组成分析[J]。中成药，2011,33（1）：42-45.），因此，认为水蛭胃蛋白酶酶解物可能是水蛭口服给药后在体内发挥药理作用的真正有效成分。

由于水蛭药材抗凝血有效成分仍未明确，故《中国药典》采用抗凝血酶生物活性测定的方法对水蛭药材进行质量控制，然而这种方法不具有专属性。已有文献报道，通过测定次黄嘌呤、尿囊素、琥珀酸等小子化合物含量或指纹图谱的方法对水蛭药材及其制剂进行质量控制（徐佳，等。水蛭的高效液相指纹图谱研究。环球中医药，2013，6（8）：596-599。/徐长根，等。水蛭冻干粉针剂指纹图谱评价。第四军医大学学报，2009，30（22）：2667-2669./袁晓环，等。复方水蛭注射液HPLC指纹图谱研究。中国中药杂志，2008，33（15）：1852-1854./中国专利CN103558329B.），然而这些成分在动物药中普遍存在，也不具有专属性。中国专利CN103558329B测定次黄嘌呤及水蛭胺等蝶啶类成分，增强了其指纹图谱的专属性。这些水蛭指纹图谱分析方法为从物质基础角度评价水蛭药材及其制剂的质量提供了方法，然而均未涉及蛋白多肽类成分，使水蛭药材的质量控制大打折扣，难以保障水蛭的临床疗效。

鉴于以上不足，本发明针对水蛭蛋白多肽类成分，利用液质联用技术，对水蛭经胃蛋白酶酶解后的次生多肽成分进行了系统分析，筛选和表征水蛭酶解多肽成分，建立水蛭酶解多肽成分的特征图谱，为水蛭药材的质量控制提供新的评价方法。

发明内容

针对目前水蛭药材质量控制方法不能有效表征其多肽成分，难以保障水蛭药材的质量和基原，尤其是对于一些包含有水蛭药材的制剂，难以保证制剂中的水蛭药材的质量和基原，故本发明建立一种水蛭酶解多肽的LC-MS特征图谱，并应用于水蛭药材或水蛭制剂的质量控制。