[发明专利]一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法

说明书

本发明构建一种检测平台既能够高效完成多步前处理步骤，又能够及时对孔雀石绿MG总量进行高灵敏测定。有益效果：本发明所述的纸基传感器集样本前处理和检测为一体，可一步法实现水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的快速高灵敏度测定。该方法利用低共熔试剂可一步法实现目标物的提取及油脂的去除。同时，本发明构建的纸基传感器具有无需复杂前处理、样本需求量少(20uL)、便携(纸基传感器尺寸：3×3cm)、成本低、易批量生产等优点。

技术领域

本发明属于食品污染物快速检测领域，涉及一种集成样品前处理和检测的纸基集成传感器在水产品中孔雀石绿总量的检测应用。

背景技术

孔雀石绿(MG)是一种三苯甲烷型绿色染料，自20世纪30年代以来在世界范围内作为杀菌和杀虫寄广泛用于水产养殖业，对于鱼、虾等多种水产的常见病如水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等有良好的治疗效果。孔雀石绿进入鱼体后迅速还原代谢为隐色孔雀石绿(LMG)。大量研究表明MG及其代谢物在人体内具有高残留、致畸、致癌及致突变等危害，其在全世界范围内相继被列为水产业禁用药物。然而，由于MG价格低廉，效果优异，目前仍有许多MG滥用的事件发生。国际相关管理组织要求检测方法能够一次性测定MG和LMG总量，并且最高检出限不得超过2ng/g。因此，水产品中孔雀石绿及其代谢产物的高灵敏度测定非常重要。

传统的MG检测方法包含高效液相色谱结合紫外及荧光检测器技术(HPLC-VIS/FL)、液相色谱联合质谱技术(LC-MS)，上述方法可实现孔雀石绿及其代谢产物总量的同时测定，具有较高的精确度，可作为金标准对其他新方法进行评估。然而，一些内在缺点如仪器体积大、昂贵，需要专业人员操作，耗时等大大降低了大量样本筛查的检测效率。为了提高检测效率、降低成本、更好地满足样本快速筛查的需求，研究工作者提出了多种性能优异的检测技术，如基于抗体的检测方法(酶联免疫吸附分析和免疫层析试纸条)，基于电化学的检测技术(修饰电极直接用于MG检测，修饰抗体和DNA/RNA等探针间接MG测定)，基于光学的检测技术(荧光传感器和表面增强拉曼技术)等，上述方法均具有较高的灵敏度、并且显著降低了检测成本和缩短了分析时间。然而，大部分检测技术需要复杂的前处理过程(pH调节、过滤、蒸发、复溶等)或者仅用于简单水质样本(养殖水和湖水等)的MG的检测。总之，繁琐的前处理步骤是限制上述方法广泛应用的主要因素。目前大部分研究主要关注于如何提高方法的灵敏度，很少研究学者考虑如何简化复杂的样品前处理步骤，并将前处理和检测集成化实现水产品中MG总量的一步法检测。

纸基检测技术由于其低成本和易于批量生产，已成为化学/生物传感器的通用平台。纸具有广泛的灵活性，可裁剪成具有复杂萨内结构的形状，这是刚性材料很难实现的功能。折纸技术可以将整个设备人为划分为不同的功能模块，从而将多步实验步骤(预处理、传感和读出)整合到一个“纸基实验室”中。研究工作者开发了多种不同的纸基检测技术用于复杂样本(全血样本)的快速分析。因此，纸基检测平台可能满足我们的需求，将孔雀石绿总量定量检测的多步实验步骤整合在同一平台。目前，据相关调研，由于水产品中孔雀石绿的前处理步骤不仅需要多种试剂参与，而且需要繁琐的仪器(振荡器、氮吹仪等)，上述缺点限制了纸基微全分析在水产品中孔雀石绿及其代谢产物的快速检测中的应用。

发明内容

本发明目的是构建一种检测平台既能够高效完成多步前处理步骤，又能够及时对MG总量进行高灵敏测定。

本发明提出了一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，包括如下步骤：

1)孔雀石绿及其代谢产物的提取及油脂的去除：利用低共溶试剂作为提取剂对鱼肉或虾肉中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿进行提取，同时与油脂分层，实现油脂的快速去除；

2)纸基集成传感器的构建：所述传感器包含3层经石蜡处理的滤纸，每层滤纸中心具有圆形亲水区，从上至下，第1层亲水滤纸替换成聚酯纤维，第二层亲水滤纸替换成氧化剂修饰的聚酯纤维，第三层亲水滤纸表面固定修饰MG抗原的碳糊丝网印刷电极材料，将上述组装的三层滤纸进行层层折叠，最终构建一步法实现蛋白去除、隐色孔雀石绿氧化，孔雀石绿总量检测的快速检测平台；