[发明专利]田菁内生芽孢杆菌ZH60、复合菌剂及玉米种培养方法

权利要求书

1.一株田菁内生芽孢杆菌ZH60，其特征在于，所述田菁内生芽孢杆菌ZH60为田菁种子内生贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZH60，已于2020年11月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21262。

2.一种复合菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的田菁内生芽孢杆菌ZH60以及田菁胶。

3.根据权利要求2所述的一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，所述田菁胶为含量1%（w/v）的田菁胶溶液。

4.根据权利要求3所述的一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，田菁内生芽孢杆菌ZH60与田菁胶溶液的重量比例为1:(1~5)。

5.根据权利要求2所述的一种复合菌剂，其特征在于，其制备方法为：

配制100ml的1%浓度（w/v）田菁胶溶液备用；

田菁内生芽孢杆菌ZH60在LB液体培养基中于37℃温度下以180rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.8；4000 rpm离心5min弃去上清液，于1%浓度（w/v）田菁胶溶液重悬至溶液OD₆₀₀=0.8。

6.一种玉米种培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步、种子表面消毒；

第二步、浸种剂配制，所述浸种剂包括权利要求1所述的田菁内生芽孢杆菌ZH60；

第三步、浸种，采用第二步制得的浸种剂浸种；

第四步、培养基配制：配制水琼脂培养基，灭菌，灭菌结束后冷却；

第五步、培养：将第三步培养的玉米种子移至第四步配制的水琼脂培养基中，光照培养箱培养；

第六步、发芽的玉米经培养后，移至灭菌后的蛭石花盆中，浇灌1/2 MS培养液，继续培养实现在玉米植株上的定殖，完成种子培养；

第二步中，浸种剂配制：称取田菁胶粉末溶于去离子水中，配置成1%田菁胶溶液备用，田菁内生芽孢杆菌ZH60在LB液体培养基中在震荡培养箱中于37 ℃、180 rpm频率下震荡一夜至OD₆₀₀=0.8后，以4000 rpm离心5 min，弃去上清液，于1/2 MS培养基中重悬，调OD₆₀₀=0.8，为菌悬液一，备用；

或者将以4000 rpm离心5 min后的田菁内生芽孢杆菌ZH60在1% (w/v)田菁胶溶液中重悬，调OD₆₀₀=0.8，为菌悬液二，备用，菌悬液二中田菁胶与田菁内生芽孢杆菌ZH60的质量比为1~5:1；

第三步中，浸种：称取玉米种子与第二步制得的菌悬液二直接混匀，菌悬液二占玉米种子的质量分数为不低于5%；

或者分别称取玉米种子质量分数10%的田菁胶和玉米种子质量3%的菌悬液一与玉米种子混匀。

7.根据权利要求6所述的一种玉米种培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步、种子表面消毒：将玉米种子用75%酒精浸泡洗去表面浮色，去离子水冲洗；2%NaClO（v/v）浸泡充分消毒，去离子水冲洗后超净台风干表面水分备用；

第二步、浸种剂配制：称取田菁胶粉末溶于去离子水中，配置成1%田菁胶溶液备用；权利要求1所述的田菁内生芽孢杆菌ZH60在LB液体培养基中在震荡培养箱中于37 ℃、180rpm频率下震荡一夜至OD₆₀₀=0.8后，以4000 rpm离心5 min，弃去上清液，于1/2 MS培养基中重悬，调OD₆₀₀=0.8，为菌悬液一，备用；

或者将以4000 rpm离心5min后的权利要求1所述的田菁内生芽孢杆菌ZH60在1%田菁胶溶液中重悬，调OD₆₀₀=0.8，为菌悬液二，备用，菌悬液二中田菁胶与田菁内生芽孢杆菌ZH60的质量比为1~5:1；

第三步、浸种：称取玉米种子与第二步制得的菌悬液二直接混匀，菌悬液二占玉米种子的质量分数为不低于5%；

或者分别称取玉米种子质量分数10%的田菁胶和玉米种子质量3%的菌悬液一与玉米种子混匀；

第四步、培养基配制：配制0.8%的水琼脂培养基，灭菌锅121 ℃灭菌20 min；灭菌结束后冷却；

第五步、培养：将第三步培养的玉米种子移至第四步配制的0.8%水琼脂培养基中，光照培养箱第一段12h光照、温度28 ℃、湿度65%；第二段12h黑暗、温度25 ℃、湿度60%培养；

第六步、发芽后再培养7天，而后将发芽的玉米移至灭菌后的蛭石花盆中，浇灌1/2 MS培养液至花盆底部刚好渗水，继续培养至少20天实现所述的田菁内生芽孢杆菌ZH60在玉米植株上的定殖，完成种子培养。