[发明专利]桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用

权利要求书

1.桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，其特征在于：包括如下步骤：

1)供试菌株的选取，包括:

分离自紫花苜蓿种子的桃色欧文氏菌(Cp₂)和番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、马铃薯丝核病菌、黄瓜枯萎病菌及苜蓿根腐病菌5种真菌；

2)供试培养基的选择,包括：

营养琼脂培养基(NA)：牛肉膏，3g；蛋白胨，10g；NaCl，5g；水，1000mL；琼脂，15-20g，以用于Cp₂菌株的培养和短期保存；

King’s B培养基：蛋白胨，20g；K₂HPO₄，1.15g；MgSO₄·7H₂O，1.5g；甘油，10mL；水，1000mL；琼脂，15-20g，用于Cp₂粉色素的培养与富集；

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：土豆，200g；葡萄糖，20g；琼脂，15-20g；以用于病原真菌的培养及对照；

粉色素PDA培养基(PPPDA)：在PDA培养基的基础上加入体积比为20％的粉色素(OD₃₄₀＝0.785)提取液,以用于5种病原真菌的抑菌活性研究；

3)桃色欧文氏菌粉色素的制备；

4)粉色素的提取纯化；

5)粉色素的波长扫描；

6)粉色素稳定性测试；

7)粉色素对病原真菌的抑制性测试。

2.根据权利要求1所述的桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，其特征在于：步骤2)中，所述营养琼脂培养基和King’s B培养基PH值选择7.0-7.2，同时在121℃灭菌20min，所述PDA培养基的PH值为自然状态下PH，同时在121℃下灭菌20min。

3.根据权利要求1所述的桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用：步骤3)中，所述桃色欧文氏菌粉色素的制备选用接种环刮取NA培养平板的菌体，单线法接种于King’s B培养基，28℃黑暗条件下培养72h左右，至菌体内包含大量色素时用药匙刮取，备用。

4.根据权利要求1所述的桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，其特征在于：步骤4)中，所述粉色素的提纯方法包括粉色素的粗提取和纯化，分别用有机溶剂浸提法和萃取法，收集培养平板内的菌体，用药匙刮取1.0g置于10mL离心管中，分别加入5mL蒸馏水、氯仿、乙酸乙酯、异戊醇、石油醚、冰醋酸、正丁醇和无水乙醇中浸泡2h，同时此过程中每隔30min用涡旋振荡器震荡1min，再用12000rpm的离心机离心15min后收集上清液，观察粉色素在各溶剂中的溶解状况，选择最佳浸提溶液和萃取溶液，从而得到纯色素提取液。

5.根据权利要求1所述的桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，其特征在于：步骤5)中，所述粉色素的扫描用紫外分光广度计光谱扫描模式扫描纯色素溶液在间隔为1nm时200-800nm的波长，以确定粉色素的特征波长。

6.根据权利要求1所述的桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，其特征在于：步骤6)中，所述粉色素的性能测试包括：光稳定性测试、温度稳定性测试、PH稳定性测试、金属离子稳定性测试、氧化还原稳定性测试。

7.根据权利要求1所述的桃色欧文氏菌粉色素的提纯工艺及其应用，其特征在于：步骤7)中，所述粉色素对病原真菌的抑制性能研究方法为用直径为5mm的打孔器在培养的菌落边缘同一圆周上打取菌饼，接入PDA(对照)和PPPDA培养基中央，每组处理三次重复，置于25℃恒温箱中黑暗培养。以对照组菌落边缘接近皿壁时为时间结点，期间连续每天用十字交叉法测量各处理的菌落直径(即为生长速率)，并计算生长抑制率；

生长抑制率(％)＝(对照菌落的直径-处理菌落直径)/(对照菌落的直径-菌饼直径)×100％。