[发明专利]一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法

说明书

本发明公开了一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法，属于芽胞杆菌芽胞的制备领域。本发明发现了柠檬酸具有提高芽胞杆菌生物量和/或芽孢量的应用。本发明发酵方法为在发酵培养地衣芽胞杆菌的过程中加入柠檬酸，将柠檬酸作为代谢调控因子来使用，能使地衣芽胞杆菌的细胞数和芽胞数得到极显著的提升。本发明具有补料成分更简单、明确、原料易购、成本低、补加方法明确、操作可控性高、适用于发酵生产等优点。

技术领域

本发明属于芽胞杆菌芽胞的制备领域，具体涉及一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法。

背景技术

地衣芽胞杆菌是革兰氏阳性细菌，分泌能力强大，生长快，是重要的工业微生物菌种。芽胞的形成受发酵环境影响，常用的提高芽胞率方法可通过培养基优化和调控温度等来实现，如：发明专利CN102533579A公开了一种优化的产芽胞培养基配方：葡萄糖0.5～1.0％，玉米粉0.5～3％，麸皮0.1～1％，黄豆饼粉0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，无水碳酸钙0.05～ 0.3％。发明专利CN106947715A公开了一种高活菌数、高芽胞形成率的变温发酵培养方法 (34-37℃培养4h，35-40℃培养8h，37-40℃至结束)。发明专利CN112831437A公开了一种芽胞杆菌高芽胞形成率的发酵方法，具体为：发酵期中添加葡萄糖维持其浓度在1％至发酵结束，后将发酵液加热至50～80℃，保持15～60min，再冷却至室温。

芽胞的形成受环境因子诱发和基因的调控，培养基中碳氮源的耗尽、磷酸盐缺乏使细胞的能量水平下降，会促进芽胞的形成。因而，总体上对促进细胞生成芽胞而言，营养不足、温度逆境等因素是普遍常用或考虑的技术手段。

出于有机碳氮源成分对芽胞杆菌生长代谢影响的复杂性、不确定性和未知性，发明专利 CN102533579A和CN112831437A采用了黄豆饼粉、麸皮和玉米粉、葡萄糖来笼统地满足芽胞生成的氮源和碳源需求。但是，这些有机氮源成分复杂、氮源和碳源用量较大，使得生产成本较高。另外，环境因子剧烈变化对芽胞杆菌生长而言也是一种逆境，因而，发明专利 CN106947715A和CN112831437A通过高温培养促进了芽胞的生成。

芽胞生成过程中会形成芽胞壁、皮层、芽胞衣等结构，其中富含蛋白质，其中芽胞衣中蛋白质含量占到了整个芽胞蛋白质量的50％，因而提高蛋白质的合成效率，比如增加氨基酸的和能量的供应等，对芽胞形成可能存在重要影响。但是这与本技术领域普遍接受的“培养基中碳氮源的耗尽、磷酸盐缺乏使细胞的能量水平下降，会促进芽胞的形成”的认知相矛盾。

虽然现有技术通过上述方法(培养基调整、营养匮乏、逆境等)可以提高芽胞生成效率，但是显然的，若能克服上述技术偏见，从增加氨基酸的和能量的供应等角度提高蛋白质的合成效率的角度进行优化，则可能使芽胞生成效率进一步地提高。

柠檬酸是微生物代谢重要的产物之一，作为络合/螯合剂广泛应用于有色金属工业；作为酸味剂、增溶剂、风味增进剂、调色剂等用于食品工业。柠檬酸还可以调控中心代谢途径关键酶如：抑制糖酵解途径中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性、促进磷酸戊糖途径6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力(微生物学报，2004(5):627-630)。另外，柠檬酸本身具有一定抗菌作用，还被用作食品防腐剂列入食品添加剂名录，而且柠檬酸与过氧化氢联合使用，可以对杀灭细菌及其芽胞起到显著的协同增效作用(柠檬酸对低浓度过氧化氢杀灭细菌芽孢增效作用的研究，袁国刚，中华预防医学会消毒分会学术年会，2014)。

但是，关于柠檬酸对芽胞形成的作用，或者是柠檬酸在芽胞形成中是否具有新的功能并没有相关报道。

发明内容