[发明专利]一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的设计及其稳定表达细胞株HEK-293

说明书

本发明先利用CVS株狂犬病病毒RABV的糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP自组装成的RVLPs为抗原，设计一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原；然后将RVGP、RVMP和EGFP共同构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，命名为pcDNA3.1(+)‑RVLPs‑EGFP。每个蛋白都具有独立的启动子(CMV)、核糖体结合位点(Kozak序列)和PloyA尾(PA)，以保证每个蛋白的表水平，同时利用EGFP实时监测目的蛋白的表达，构建真核重组表达质粒；而后将真核重组表达质粒转染HEK‑293细胞，细胞经扩增和传代后，进行筛选和鉴定，筛选得到稳定高效表达RVLPs的阳性单克隆细胞株HEK‑293/RVLPs。获得抗原具有哺乳动物细胞的翻译后修饰，克服了细菌、酵母、昆虫以及植物细胞来源的RVLPs由于糖基化修饰不正确而表现出低免疫原性，为RVLPs抗原的规模化生产奠定了基础。

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种广谱性狂犬病病毒样颗粒(RVLPs)抗原的设计 及其稳定表达细胞株HEK-293的筛选和鉴定。

背景技术

狂犬病(Rabies)是一种古老的且最容易被忽略的人畜共患病，主要由致死性病原体 ——狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引发(Zhao R Q,Shan Y,Li M H,et al.NovelStrategy for Expression and Characterization of Rabies Virus Glycoprotein[J].Protein Expression and Purification,2020,168:105567.Liu,Zhao W,He W T,etal.Generation of Monoclonal Antibodies against Variable Epitopes of the MProtein of Rabies Virus[J].Viruses,2019,11(4).)。 犬类是RABV最主要的宿主，超过99％的人类狂犬病是由狗介导的(Navid M T,Li YY, Zhou M,et al.Comparison of theImmunogenicity of Two Inactivated Recombinant Rabies Viruses Overexpressingthe Glycoprotein[J].Archives of Virology,2016,161(10):2863-2870.)， 其唾液中的RABV通过伤口处的皮肤或黏膜经突触扩散到周围神经，并逆行至中枢神经 系统(Centralnervous system,CNS)，在大脑中快速复制并导致脑损伤，致亡率几乎 100％(Johnsona N,Cunningham A F,Fooks A R.The Immune Response to Rabies Virus Infection andVaccination[J].Vaccine,2010,28(23):3896-3901.)。