[发明专利]一种人精子膜蛋白SPACA3特异性多肽与抗体的制备方法

说明书

一种人精子膜蛋白SPACA3特异性多肽与抗体的制备方法。C端特异性多肽氨基酸序列为：AMKITQEPQGLGYWEC。抗人精子膜蛋白SPACA3抗体按以下方法制备：(1)特异性胞外抗原表位分析与设计；(2)特异性人工多肽合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔多克隆抗体；(5)收集、分离、纯化获得抗体。本发明制备的特异性抗人精子膜蛋白SPACA3抗体效价高、亲和力强、特异性好，可在体内和体外与具有天然活性的人精子膜蛋白SPACA3抗原表位发生特异性结合，可用于荧光免疫和酶联免疫吸附实验。该抗体不仅对研究人精子膜蛋白SPACA3蛋白特性、功能、表达谱和相关疾病提供一个重要工具，还在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有应用前景。

技术领域

本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，该抗体是用于人精子膜蛋白SPACA3蛋白的基础研究的重要工具，还可在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有很好的应用前景。

背景技术

精子获能是两性生殖过程的重要步骤，获能过程中精子细胞膜从非生育状态转化到生育状态。当精子获能后，精子膜蛋白、糖蛋白、脂质成分和精子质膜通道发生多种分子结构的变化，一方面出现精子头部质膜成分损失，尾部细胞膜改变，发生精子超活化；另一方面精子对卵细胞及其相关结构(颗粒细胞，卵透明带)提供的信号进行反馈并发生顶体反应(AR)。出现顶体受体的激活、顶体膜与精细胞质膜融合、顶体中水解酶的释放、卵细胞外被(透明带)的水解等过程，最终促进精子-卵母细胞融合。精子顶体区上的这些受体、糖或蛋白质分子可以作为抗原直接产生抗精子抗体(AsAb)，从而妨碍精卵融合，引发男性不育。由于缺乏精子顶体膜蛋白特异性抗原位点和抗体的研究，AsAb引起男性免疫不育症的作用机制尚未明确，因此借助分子生物学、生物信息学和高通量测序等技术的跨学科应用，进一步揭示精子顶体区、颈部和尾部精子表面膜蛋白的特异性抗原位点在两性生殖过程中的作用机制，构建特异性免疫不孕不育靶向治疗方法等一系列的科学问题，是促进健康生育、构筑人口安全的重大需求。

(1)SPACA3的功能：SPACA3基因位于17q11.2DNA正义链，长度为27,502bp，有6个外显子，具有一个保守结构域与c型溶菌酶具有高度同源性。已经发现该基因的3种转录本亚型：NM_001317225.1、NM_001317226.1和NM_173847.4。SPACA3蛋白质215个氨基酸，分子量23,431Da，分为2个亚型，分别是单次跨膜Ⅱ型膜蛋白和分泌蛋白。人类精子顶体中的SPACA3蛋白质定位于顶体基质中，主要存在于顶体前区和顶体赤道区。在获能的类精子中，在顶体区内膜和外膜上均可观察到SPACA3蛋白。SPACA3的功能尚不清楚，有研究显示，尽管编码的蛋白质在氨基酸水平上与溶菌酶具有显著的相似性，但是目前未发现该蛋白具有杀菌活性。SPACA3与c型溶菌酶具有相似的结合特异性，可与卵母细胞透明质酸结合，促进精卵融合在受精过程中发挥重要作用。

(2)SPACA3抗体产品的信息：经检索,市场上有SPACA3蛋白的多克隆抗体,但是这些抗体的抗原表位不同。上述SPACA3抗体仅能在蛋白变性处理后进行体外检测，尚不支持对具有天然活性的人精子膜蛋白SPACA3进行功能和表达谱方面的研究。(3)SPACA3抗体的功能：有临床报道，在不孕不育夫妇的血清中发现SPACA3抗体，动物实验也证明，该基因编码的蛋白质位于精子表面，是卵细胞表面寡糖残基N-乙酰葡糖胺的潜在受体，参与受精前精子与卵细胞表面的粘附和融合作用。使用抗小鼠SPACA3抗体检测小鼠SPACA3蛋白主要定位于顶体反应前的顶体区，在获能和顶体反应后位于顶体区赤道段。在小鼠体外受精实验中，SPACA3抗体对精子和成熟卵细胞的结合有抑制作用。SPACA3可能是卵母细胞特异性膜金属蛋白酶(SAS1B)的配体。SAS1B位于卵细胞微绒毛卵囊膜上，而SPACA3抗体可以干扰SAS1B蛋白，显著抑制精卵结合的受精作用。

发明内容