[发明专利]一种固定化双酶-无机杂化纳米花及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及酶固定化技术领域，尤其涉及一种固定化双酶‑无机杂化纳米花及其制备方法与应用。所述固定化双酶‑无机杂化纳米花的制备方法包括以下步骤：(1)将酶液与磷酸氢二钾混合，然后调节pH至6.0～6.1，得到酶的磷酸盐溶液；(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置，离心得沉淀，并将沉淀洗涤。本发明解决了传统固定化酶技术操作复杂，成本高，所得固定化酶活力低的技术问题，本发明制备得到的固定化双酶‑无机杂化纳米花的稳定性优于传统树脂载体固定化酶，而且酶活高于传统固定化酶活。

技术领域

本发明涉及酶固定化技术领域，尤其涉及一种固定化双酶-无机杂化纳米花及其制备方法与应用。

背景技术

D-(-)-对羟基苯甘氨酸，化学名为D-α-氨基对羟基苯乙酸，分子式为(OH)C₆H₄NH₂CHCOOH，分子量为167.2，化学结构式如式Ⅰ所示。

D-(-)-对羟基苯甘氨酸是β-内酰胺类半合成抗生素阿莫西林、阿扑西林、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢罗奇和头孢哌酮等的侧链，是国家重点发展的一种药物中间体。国内的D-(-)-对羟基苯甘氨酸长期依赖进口，仅河北省制药行业每年为此花费上千万美元的外汇，因此有必要对该中间体的生产进行系统研究，研发一种经济高效的新生产方法。

生物酶催化具有作用条件温和、绿色无污染、独特和高效的底物选择性等优点，被广泛应用在医药、食品、化工以及环境保护方面。但是游离酶在使用过程中常常表现出稳定性差、难以重复使用、使用成本高等问题。酶的固定化技术是提高酶稳定性、改善酶催化性能的主要方法。固定化的酶不仅易于与底物、产物分离，而且可以长时间内重复使用，降低成本。并能够在绝大多数情况下提高酶的稳定性，且能够用于多酶级联反应。但是，传统的酶固定化制备过程繁琐，载体的存在导致酶和底物的传质阻力增大，以及共价键的形成使酶分子构象发生改变，从而导致酶活损失较大所制备的固定化酶酶活较低。因此，开发新的催化活力高、稳定性好的酶固定化方法成为提高酶催化性能亟待解决的问题。

酶-无机杂化纳米花是近年来发展起来的一种新型固定化酶方法，它具有合成步骤简单、条件温和的特点。而且与游离酶相比，所制备的杂化纳米花固定化酶表现出更好的催化性能。因此，酶-无机杂化纳米花是一种极大潜力的固定化酶方法。纳米花在化学中是指某元素的化合物，从微观观点形成了花，称为纳米花。这些形成物的长度和厚度都在纳米范围，因此只能用电子显微镜观察。固定化双酶-无机杂化纳米花技术，不仅大大降低了传统固定化载体的成本，同时实现了一酶双用，而且提高了固定化收率，固定化纳米花的酶活远远高于固定化载体的酶活，稳定性也远远高于固定化载体。

因此，如何克服传统固定化树脂载体的活性不高，稳定性差和重复使用性差的缺点，提供一种操作简单、成本低、重复性好，所得固定化酶活力高的固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化双酶-无机杂化纳米花及其制备方法与应用，解决了传统固定化酶技术操作复杂，成本高，所得固定化酶活力低的技术问题。本发明制备得到的固定化双酶-无机杂化纳米花的稳定性优于传统以树脂为载体的固定化酶，而且酶活高于传统固定化酶活。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：

(1)将酶液与磷酸氢二钾混合(混合后的溶液pH为8.0)，然后调节pH至6.0～6.1，得到酶的磷酸盐溶液；

(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置，离心得沉淀，并将沉淀洗涤。

优选的，步骤(1)所述磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为1～3g∶80～120ml。

优选的，步骤(1)所述酶液中含有D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶。