[发明专利]一种刺参基因编辑体系的构建方法

权利要求书

1.一种刺参基因编辑体系的构建方法，精、卵获取、显微注射用卵细胞固定、目标基因sgRNA设计、配置注射体系和显微注射，其特征在于：获取刺身精、卵，获取后将卵细胞固定排成单细胞列，并对其受精，经配置的含刺参目标基因sgRNA的混合液注入至上述排成单细胞列的受精后的刺参卵细胞中，注射剂量为刺参胚胎体积的8-12%，在23℃下孵育显微注射后的胚胎，进而可获得刺参基因编辑体系；

刺参卵细胞固定于含硫酸鱼精蛋白溶液的培养皿中排成单细胞列，而后将精液打入培养皿中，使卵细胞完成受精；固定后受精的刺参卵细胞在显微镜下注射含刺参目标基因sgRNA的显微注射混合液；

所述含刺参目标基因sgRNA的混合液为每微升混合液中500ng Cas9蛋白、300ng 目标基因的sgRNA、0.2μl 20%甘油、0.2μl FITC和0.16μl RNase-free水；

或所述含刺参目标基因sgRNA的混合液为每微升混合液中750ng Cas9蛋白、375ng 目标基因的sgRNA、0.16μl 20%甘油、0.2μl FITC和0.04μl RNase-free水；

或所述含刺参目标基因sgRNA的混合液为每微升混合液中250ng Cas9蛋白、250ng 目标基因的sgRNA、0.2μl 20%甘油、0.2μl FITC和0.3μl RNase-free水。

2.按权利要求1所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述固定为在显微注射用的培养皿底部背面划线，并将培养皿内用0.1%-1%的硫酸鱼精蛋白溶液润洗，而后用口吸器将卵细胞整齐地排列在涂有硫酸鱼精蛋白的注射盘表面划线处。

3.按权利要求2所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述润洗为将0.1%-1%的硫酸鱼精蛋白溶液涂在培养皿上，沥干或者晾干，然后立即用去离子水漂洗，待用。

4.按权利要求1所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述刺参卵细胞的获得为利用神经肽NGIWY-NH₂促熟刺参获得其卵细胞。

5.按权利要求4所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：将10 μM 的NGIWY-NH2注射入刺参体腔中，注射的量约为刺参体积的10%-15%，以刺参开始出现摇晃身体的现象起15-20分钟后排卵，收集刺参卵子。

6.按权利要求1所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述刺参目标基因sgRNA的获得：根据CRISPRscan设计gRNA序列，并根据CRISPRscan score选择分值高的gRNAs, 配置显微注射混合液时，可以每条序列单独使用，也可以全部混合使用或者组合使用。